miRNA模拟物的转染体系与步骤

runsong

希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。) X, V# i0 ~: L! t8 O: _
我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

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! x0 s: W2 w! m' p& O. \, A! i' W% Q, q. F. i7 f) t+ c, U3 m$ N
大家看能不能参照这个
( `8 v" ?# Z' y$ m- F0 U: tsiRNA 的转染（24 孔板为例） 5 c; g0 ]$ s8 O+ D/ q2 {# Z; R# S0 ]% T
I．准备细胞：
) R5 Q9 C: s: M6 Q' _2 g9 E* V4 s贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  
7 o+ M2 v+ k$ k! g% z8 Q3 Y悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。
7 ~' ^) P, A) n1 o3 |) g
2 f4 m& o: H" B: U% F* r2 a9 WII．对于每个转染样品，按下面的方法准备： 9 ^1 ~  T* e0 |. ], Y, x) k
  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。
0 f$ r1 E8 j3 r* K/ L! I5 C  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。
+ c  B4 l, j! l% Q0 O+ F  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  
7 |5 V+ x! a' v  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  2 x* \# l  c/ ~3 o! `
  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。

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自己顶。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。: f  l# U5 z4 o
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
" B) h5 Y) h; U. q$ x" ^B. siRNA-RFect混合物准备：* \5 ?% x4 A! \
1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。1 V, q6 L+ Q% q5 v5 e+ F7 e9 y
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。) U) U; H5 P" ?( y" k# b* N
3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。
. m; I! M/ l. `% F2 L. qC. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：1 P- ?8 v$ {& }" [: z' Z
1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。
8 T5 M- X$ U$ p9 F2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、% e. T# g. ~" l% ?, I# q/ p
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

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十年了