miRNA模拟物的转染体系与步骤

runsong

希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。
( X$ d" y$ P9 F) \我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

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9 C3 K: S3 p4 y) G

% e. `8 G' R% Y( M3 v大家看能不能参照这个
* m, M* S+ \7 ]1 K' Y3 `/ msiRNA 的转染（24 孔板为例）
4 S, d) H% i$ r) |7 VI．准备细胞：
( ~6 e1 t5 E: E0 h& B! E8 L- l' O贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  
  K6 b$ w9 D- P5 Z" H; w/ X悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。 ( M6 r( I' }; h" H7 \
4 k+ G. g7 k, O% ?
II．对于每个转染样品，按下面的方法准备： . L+ H4 q  a/ i( ?% v. D7 b
  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。
+ {, ~/ B, r+ s" ~. C  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。
1 E. m/ y7 s* N2 l- a  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  
* m4 F& \, J- x4 q( |8 Q  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  
- E0 y- p7 ^5 I  d  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。

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自己顶。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。
' D! v+ K' `5 Q' N4 bA. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
, _" {6 U* o9 L. Q9 l$ IB. siRNA-RFect混合物准备：
6 r8 R& Z" B. i" w- i) q1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。* e3 _% x7 z5 j) C* f5 f& ~$ f
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
2 o; D6 [( h: v# E2 d3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。4 k4 T' Y+ w+ v3 C# P7 j# O
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
( X% q( W0 |+ y1 A1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。( o) \9 O5 X  j
2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、
, y8 e: B: J0 u0 [: Q: B& ]所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

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十年了