miRNA模拟物的转染体系与步骤

runsong

希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。
1 v) V4 |! [, a( r我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

runsong

0 R' y8 ~+ k5 P5 i
0 `2 L2 V3 r9 u9 p8 l大家看能不能参照这个
2 ?( f; A6 d1 H: u- }. x$ z) TsiRNA 的转染（24 孔板为例） 9 ~0 {2 t0 }+ K( b/ ~$ n
I．准备细胞： 3 n$ `" j+ T& @: W1 q# L' N
贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  9 i' k% R# u2 C7 Q; c
悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。
" O! \* h) Z. D1 N9 v* U5 H
! [" b' j9 w2 LII．对于每个转染样品，按下面的方法准备：
$ Y" f, h' J, v/ q2 s  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。 # D9 e4 T5 l, X( e2 D$ j# j
  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。 ) G$ J) F7 o) @: a$ h  I
  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  
5 s( g% C* a: Q9 Q9 B; z- o  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  
6 M& A7 H5 c4 d7 f% o2 c- @: \  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。

runsong

自己顶。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。4 n* @2 w" x6 E% E0 s
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。3 ]9 P/ W2 ^' s' q+ S0 _) S
B. siRNA-RFect混合物准备：
" T$ P- A6 \  `9 E: H/ a1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。' y; n  o+ d9 }4 I3 u5 O; q- C
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
9 g! R1 p, O; W9 l8 J+ Y/ L3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。4 s% ]) x$ F$ u! W$ k1 n
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
6 O1 }( K8 U( l. G1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。$ q$ _+ R% L" l0 e- J/ {# H
2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、3 ]9 s- s+ U+ W# W! L7 \
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

runsong

十年了