miRNA模拟物的转染体系与步骤

runsong

希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。
3 d  ?) g  P( i3 z" B我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

runsong

十年了

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。
5 ?7 U) d% J, o" ]) g' xA. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
9 f7 |7 {  O$ d( n: _* fB. siRNA-RFect混合物准备：1 j# ^. U1 v. O" L5 w
1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。% l+ U- j7 J7 P8 j% Q- _
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
" A& v* c9 O2 V9 w# W- g3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。
: b( E/ Z7 e9 `* Z6 GC. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：9 ]# c% z2 s/ K$ @
1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。( M0 @' C7 y( I+ Y/ d) ?+ y
2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、/ h( [# X9 ~. B- l: F2 V  h5 Q
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

runsong

自己顶。

runsong

7 r6 r. H: z3 P
- R0 F3 b7 |/ l0 Y& y: I大家看能不能参照这个
7 i' G2 S' u/ ]' R9 r/ gsiRNA 的转染（24 孔板为例） ! z# f) l! N+ m6 U2 c7 n: H
I．准备细胞：
$ _+ T+ E: Q" A- y贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  
4 R# q3 G1 s6 B" Q0 Y# L) ~* ^悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。 ) e; Z* X/ G6 V6 y( F5 k7 `
7 m$ r+ v! l9 N( o, V/ F% X& O& v
II．对于每个转染样品，按下面的方法准备：
! Y* H. U+ j/ _! B3 {0 t  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。
0 _* E& v: M) ]9 d$ j# s+ e  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。
3 U4 {( K0 b. w6 U  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  
# T' o- o- ?: m" d* J  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  $ H* v' _4 s6 L  P# }, F) F3 A
  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。