miRNA模拟物的转染体系与步骤

runsong

希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。3 O- v7 k, I  M( j1 M! w
我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

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7 u2 K4 s( H9 [( g* {8 i0 r

- ~# L' v3 r  u大家看能不能参照这个5 J. H" u* V* {1 V" V
siRNA 的转染（24 孔板为例）
" ]5 W2 g0 K) cI．准备细胞： 0 N: m( h7 x# R4 Z+ R. |  i
贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  8 u7 N* w+ v) e/ ^5 O# c9 p" w' S' h/ Z
悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。 ( N9 @" O% o: F: U/ ^4 q
1 R( j. L8 H5 z$ l
II．对于每个转染样品，按下面的方法准备： - b2 _8 i; S) G4 s* X
  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。 % _& q, a$ ]* J: s
  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。
. _. G) K/ C% ?: e3 v: E! g  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  / |; b/ r3 r9 o) a. q
  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  : D3 Z2 Y' N  B) i% m
  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。

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自己顶。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。
" I0 S' F4 ]( z9 U$ rA. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
/ Y- c1 X4 x7 b' y8 N8 R( Q2 oB. siRNA-RFect混合物准备：
( Q% S  |# P/ V7 B1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。
* z, o: Z8 r) e2 z& d2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
( n: ~6 a/ C' _/ c8 i: Q3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。
/ a; A9 l# V$ I6 \/ R- gC. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
% F4 _8 x4 {& o6 r1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。
7 \! V+ Z, ?" s, b2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、
) r9 m1 c6 F/ g所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

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十年了