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1、取材* k3 x; u+ i, T! E9 q
要挑选活力较好的部位，取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。* U/ a, E$ O1 b8 E
2、培养基( q8 x3 C; _: D7 {5 Q- W
一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
" f% r% T* u1 h: P4 { H
( m1 B' S) k3 X/ | Z& ]3、成纤维细胞的排除：1 Z% N6 F( Y8 Z1 @
3.1 机械刮除法：, j# U: E& g1 C7 m( C, J3 Y
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：: {4 O1 Z' L) W6 p- a4 ^" `7 ?1 P
（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；
! [) ~5 I6 u, U: z2 [) H2 F（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；
# n4 a5 y1 B2 M$ @' D6 W1 k: `( E（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
) `, m, b( S) v. z（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止- A! }( M' N4 O4 a
3.2 反复贴壁法：6 D4 X2 {$ t$ M5 U
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。
: o/ ^6 X+ {9 P+ H/ ~5 n3 j（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液； d: T/ P, C0 x: v0 f
（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；- B1 V8 G) b7 o
（4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。. J$ G; w6 o& _$ `& m/ c
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。, S: [+ U- o. d! n Z& J
3.3 消化排除法：
1 i) S3 a' e# h* p. f0 G此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：/ }# k# W( U! q m% ^/ w+ d9 P
1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；( `( G% h m* |) H# c; M: O
（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
- d7 @1 C( O9 I: Y/ A' n3.4 胶原酶消化法：
& }" Q4 s* U2 f0 m本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
* j* x$ q& H7 `$ H（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；+ I! h7 p: m( P8 Q( Y3 q
（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
7 y5 y% I; D4 F# D3.5 其它方法：
9 }2 V2 o1 |0 ^0 K! w% Q# ]有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g离心10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1.050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。% k0 P( E: M$ U s
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。" j2 \( m( F& f3 T
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4、操作
# G- m6 C% d! [) w: t$ f1 A7 F用医用弯头剪刀剪切组织，然后用胰蛋白酶进行消化处理。
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发表于 2011-8-1 10:35
