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1、取材5 R" J9 f k! A1 {. B
要挑选活力较好的部位，取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。) a9 U7 f; ?. m, ~8 K
2、培养基
! |0 X- j- o8 y( N' [& d6 J一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
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7 U$ G# h5 \) K2 ^; ^, z3、成纤维细胞的排除：* w. T% y$ b2 s$ [- |4 ^
3.1 机械刮除法：
, o& R3 O5 f p' G" X是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：
8 m* f: X5 f5 J+ {8 ?4 a（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位； Y) I5 G4 \+ |. Z7 T
（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；
! y* E0 s2 z8 K) ^+ b8 a（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；( `7 _% ^1 B2 T! g
（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止
1 U% k- f9 U' D: [! r8 A+ f3.2 反复贴壁法：& r2 j; r0 b8 y; A1 {- e$ }
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。. F9 a8 M7 p9 J; v4 e
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；
) T6 @0 u' A6 K( x( F% ?6 o（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；: f- U& c0 b' U5 |* n1 k$ ?
（4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。
8 F% h0 }6 A5 |+ v3 y& r7 _当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
% D& t1 {; r9 J$ k3.3 消化排除法：
9 S7 m' [) m" R6 Y2 L" S+ i! i, G, d此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：1 x; c/ ]; G0 w" o
1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；
M! M- _# J0 c7 N% y（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
" p" X) e- ?5 R& A& O$ ?3.4 胶原酶消化法：3 y3 K" W F7 j+ B2 G
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
8 a8 _; w9 B$ [1 s; H h$ d# R7 ^（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化； s. m3 f @' S+ ~ K" l d \
（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。8 M; }4 e. E1 @" t
3.5 其它方法：
1 u' F2 z$ W8 U" j1 p3 `8 J. C有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g离心10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1.050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
9 \0 t0 P% [' z选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。) v7 _' h' O1 H0 s- K
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4、操作
$ T {) _+ I4 h. {" @# b用医用弯头剪刀剪切组织，然后用胰蛋白酶进行消化处理。
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发表于 2011-8-1 10:35
