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1、取材! ^- D) c1 @) m
要挑选活力较好的部位，取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。. w7 l3 A4 B, Y$ R
2、培养基- P# x1 f' H# I; ]6 K: W# S
一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
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3、成纤维细胞的排除：! {1 t! W4 p9 [! e) W5 e& [7 {$ T+ _
3.1 机械刮除法：4 r5 o4 w" m8 H1 p
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：
" w/ k7 x ]& P（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；( u+ g$ z9 _( `# a5 R0 w
（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；7 n2 ^7 @7 b3 d: {4 @' u/ K0 O
（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
% x; h1 W+ z2 X8 c. D（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止- l9 N& n0 [' ?& o( w0 V4 ~3 @
3.2 反复贴壁法：
( G* C" V% H8 e: m- U3 e根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。1 O: f- B/ n/ j3 ]
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；/ T) B1 f! z# S, H
（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；
! \* e s9 o' ~' ?+ A（4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。8 D d3 ]. T) V1 t+ `
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。. \; y- W3 r$ d# ^) e
3.3 消化排除法：
8 y5 J( P9 r2 t此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：
0 g0 A! r! _4 |3 X$ j0 I3 |3 M* t1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；
6 g; n! O1 d) }7 \% u（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。9 j4 H H \; z4 \+ X- d1 F- r# U
3.4 胶原酶消化法：
: p, B8 w! w3 w7 p+ M7 n. j1 Z本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。* T3 F5 G: T- x5 K8 T4 \* I
（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；. h( h6 T# O) P! f6 `
（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。! U: o! v0 z0 \5 P& c
3.5 其它方法：1 j9 M* w: o* z. }1 |
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g离心10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1.050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。1 `+ h- W5 l0 I4 ~1 }- T. ] K" s
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。
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- I# [4 f5 d0 P2 i4、操作
) r1 \# Y8 H M1 s. e用医用弯头剪刀剪切组织，然后用胰蛋白酶进行消化处理。
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发表于 2011-8-1 10:35
