请教：T载体连接原理

runsong

        这是困扰我多时的问题，大家都知道用Taq酶扩增的PCR产物由于3‘端含有突出的A，可以连入T载体。但由于普通合成的引物的5’端没有磷酸基，致使用Taq酶扩增的PCR产物的5‘端是没有磷酸基的。现在我的问题是T载体试剂盒是如何实现△处的连接的。
( H" Z  d9 z( w        我的看法是体系中含有5’磷酸化酶，PCR产物的5‘端先加上了磷酸基。大家有何看法呢？8 U8 Q. S$ k5 ?& M3 u& {9 V; i
6 [! A. a/ Z4 M- X  N
        如果是这样的话，那么我们用合成引物再退火的方法得到的片段是不是可以用T载体试剂盒提供的试剂进行连接，以简化实验流程。

initiation

我认为将Taq 酶PCR聚合产物与T载体连接不需要磷酸酶，尽管我们普通合成的引物5‘端为-OH，而不是磷酸基团，但是T4 ligase之类的连接酶可以将PCR产物3’段-OH与T vector 5‘端磷酸基团连接形成3，5磷酸二酯键，然后剩下PCR产物5’端-OH与T vector 3‘端-OH无法连接，产生gap。当我们将这些带有gap的质粒转化E.coli后，细菌体内的DNA修复系统可以将PCR产物与T vector完整连接起来，成为名副其实的PLASMID.

yourwish140

学习了

weiyepan

不知道你所说的合成引物退火得到的片段是不是一个短片段。
% U+ h. [( l! \7 L- m) m转化大肠杆菌是只要你两个gap之间的序列够稳定，转化到大肠杆菌都可以自己修复的。

xiangchou812

二楼说的很对，不过若是载体再去磷酸化的话就不能再用未经处理的PCR产物进行连接了。或者说不能将两段PCR产物直接进行连接。

POPOLD

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2 L( E% i; Y  x$ q3 Q* O% f) R7 N) e
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xbcrown

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xbcrown

论坛貌似有点小问题。。。。。