求教：OP9细胞与ES共培养

wang66

最近尝试按照文献做OP9与ES共培养向造血干细胞诱导分化的实验。) H% v6 n5 _2 x, s9 I, L) Z, z
按照文献说明：
4 s8 S/ B' p5 a1.OP9培养到第4,5天半量换液，再继续培养到第8天可以用于共培养。: A7 }$ P6 p  f7 \  o
2.ES与OP9共培养在第4,6,8天半量换液，最多不超过10天共培养。
' s- G' T% a. `8 r8 F2 A& [0 ]. f! _& ?" h
但是在实际操作过程中还是有很多问题出现：# |/ S# t) ~& s  z/ d) G0 j  i
1.OP9（20%FBS+α-MEM）生长速度太快了，虽然通过半量换液想使细胞达到亚死亡状态延缓生长，但往往养到第7，8天细胞就基本覆盖了95%以上甚至100%，很多细胞都挤在一起。
1 u/ W$ h- v1 f6 ^9 P2.ES是制备成单细胞共培养还是使用克隆团块同培养文献上没有说得很清楚，之前尝试使用克隆但效果不好很难贴壁，使用单细胞在共培养的头几天看上去还行，但到了第6天以后又有很多细胞飘起来，不知道是OP9继续长挤到细胞了还是别的原因。3 k  s, T5 X0 q$ d
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所以现在想请各位前辈支下招：) A* k8 [  v# W. p# w; B( H
1.OP9长得太快的问题：是不是不要加血清直接用培基？或者在共培养之前使用丝裂霉素或照射？* g/ x! q  k9 z3 j$ m0 U- K
2.是使用克隆还是单细胞ES共培养？; R5 P7 H% K, L7 Q- I# o
3.共培养到第6天以后就陆续有细胞飘起来，有没有人碰到过这种情况？会是什么原因引起的呢？6天以后的正常图片应该是什么样的呢？* i6 w. p& n! u( B9 M, O3 s

" ?1 A1 t; N) m5 n下面加上几张图片，也请各位帮我看看，先谢过各位啦！" j5 Z; p8 B  J8 s+ G. d
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wang66

# z( P  `0 }0 \1 V& g; x

! E1 i& h. g2 L2 F9 Y4 H这是OP9第一天的情况
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8 O+ r/ y3 d/ c% S" T# ^$ I
/ `# o3 J$ ?. i这是OP9第6天的情况1 b! {! O  k  ^+ p9 `6 c# [3 D

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这是共培养第1天的情况, X+ W; M. {7 F. W

' ~* S. O- N+ g/ Q$ X5 Y9 a# h" e, y
这是共培养第4天的情况，已经开始出现了黑色的物质？
" p) z& n' d! s1 r8 w) }4 p$ S6 N2 V' K7 c: ~" P5 c

- Y6 U5 }( f1 f: u& U7 C) L这是共培养第5天的情况
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: f' G  j0 M- L0 o( ^# O
2 p8 A( s: V  h; e4 M这是共培养第8天的情况
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/ w2 [' ^' x0 g. V  ?/ G! d" R第8天很多细胞都飘起来了
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bitgene

我做了好长一段时间的OP9与ES共培养向造血干细胞诱导分化的实验，现在越做越差。从你的情况来看，应该是要做人的ES细胞分化吧，人和鼠的ES细胞分化会有些不同的。OP9与ES共培养向造血干细胞诱导分化的实验的最关键的就是OP9的培养，只有将OP9培养好了，才能成功的进行诱导分化。从你的图片来看，后面细胞掉下来了，估计是没有0.1%的Gelatin事先铺板。另外，第四天开始，有黑点出现，实际上是OP9分化成了脂肪细胞。培养OP9细胞，血清非常重要，血清不好，就会分化成脂肪细胞，现在我也为这个情况头疼。因为培养OP9细胞需要Hyclone的SH30070.03这种血清，这种血清在Hyclone的官方以及他的正规代理商都不在中国大陆销售，而市场上却有很多这种血清卖，搞得我办法判断它的好坏。不知道这些血清究竟是走私的，还是山寨的，反正用起来时好时坏，搞得实验也没办法重复。所以，咱们多交流交流，特别是怎么能搞到正宗的SH30070.03血清，这个非常重要。

bitgene

对了。我的QQ:191445，多交流