请教各位：关于ES和OP9共培养向造血干细胞诱导分化

wang66

最近尝试按照文献做OP9与ES共培养向造血干细胞诱导分化的实验。( t( L0 s  B; i1 v  \( J
按照文献说明：7 r: e, r  B3 Z9 O: H1 ]: r, ?
1.OP9培养到第4,5天半量换液，再继续培养到第8天可以用于共培养。
  _" e2 J( R6 X4 r  y) C# ^2.ES与OP9共培养在第4,6,8天半量换液，最多不超过10天共培养。# n! |* N( h2 K# l/ r% u: t: \
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但是在实际操作过程中还是有很多问题出现：
- L) _0 |3 u, ?+ l( x& S0 K1.OP9（20%FBS+α-MEM）生长速度太快了，虽然通过半量换液想使细胞达到亚死亡状态延缓生长，但往往养到第7，8天细胞就基本覆盖了95%以上甚至100%，很多细胞都挤在一起。
( }! P  X/ ^- i5 r# I8 ^+ Y2.ES是制备成单细胞共培养还是使用克隆团块同培养文献上没有说得很清楚，之前尝试使用克隆但效果不好很难贴壁，使用单细胞在共培养的头几天看上去还行，但到了第6天以后又有很多细胞飘起来，不知道是OP9继续长挤到细胞了还是别的原因。
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  x2 y$ ]9 a& C. O2 R; W, P$ |所以现在想请各位前辈支下招：7 k* Y8 H1 `; u/ M5 m
1.OP9长得太快的问题：是不是不要加血清直接用培基？或者在共培养之前使用丝裂霉素或照射？
) d6 z0 d  W& @- j; Z! _2.是使用克隆还是单细胞ES共培养？
; n9 M7 |( w: O) e- l8 s2 x3.共培养到第6天以后就陆续有细胞飘起来，有没有人碰到过这种情况？会是什么原因引起的呢？6天以后的正常图片应该是什么样的呢？" t" M5 A: f' }9 [2 N
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下面加上几张图片，也请各位帮我看看，先谢过各位啦！
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梦想lab

是不是OP9密度太低的缘故

殆死悲爱

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# \, \' Q0 b/ G. M' p1 R# R/ r  m! K( n- ^. S+ k
差不多

wang66

殆死悲爱 发表于 2011-8-22 10:34
( ?" U0 ~0 m0 R# Q( x回复 wang66 的帖子
4 Y, S. A% {& J: D3 ]' I: \& j  I: M) @' d
OP9状态不好

9 h8 o, O# ?8 e+ a  j0 X处理的方法就是像MEF那样处理么？在共培养前一天？

殆死悲爱

回复 wang66 的帖子
- Z8 z; o8 k& `+ t
2 ^& U7 N$ A6 f: k3 r, uOP9状态不好" \9 I. @$ [2 K
OP9要用丝裂霉素C处理

yuanyan2010

op9是不是可以用丝裂霉素处理下子？

wang66

1 h  Q% ~5 \# p7 X7 j  vOP9第1天0 q/ ?2 q5 E6 m* l1 _  I

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6 J$ D  L& Z# @! s1 L4 EOP9第6天（第4天，第5天半量换液）
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+ @. q% G) p/ f共培养第1天（种植单个ES细胞）
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共培养第4天（已经可以看到一些黑色物质了）
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6 ^1 m: @. P: p$ B; I% \共培养第5天8 a' u9 h7 O; h- L1 Q5 t
) ^& P2 s4 M0 K7 U0 D2 F

! h) M4 X+ ]6 |$ r8 K. H4 K' Z共培养第8天
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共培养第8天（已经有细胞漂浮起来了）
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恳请各位高手前辈帮我分析下~多谢各位啦！