酶消化法 原代培养 无细胞

hxf_86

各位战友，首先感谢！
( M7 R6 @$ U3 y8 _0 p我做原代大概过程：( ~! X5 T6 W0 Y6 g! G5 o
1、取出组织块后，常规清洗，剪刀充分剪碎- Y, f7 R: B9 z5 m) L
2、然后COL 1+dispase等比例混合消化（浓度分别是2和4mg/ml，总体积3-6ml），50-60min，水浴. P: E3 ]+ `( G5 H2 T
3、含20%FBS的培养基6-9ml中止消化" a% f  E" V, Z% M  w
4、200目筛网过滤，500g，5min
- M9 ]. y2 u6 r7 Z离心结束后，可以看到明显的沉淀，但是细胞计数板计数，镜下观察没有细胞。
+ }8 o3 o% ^- `; P请问是什么问题？谢谢！
: U4 L, V0 C4 g3 J$ K' n1 |& b) ]

evial

嘿嘿，你的细胞没有滤过去，还在渣滓里呢，也就是在你滤网里面，200目太大了吧，是纤维组织沉淀下去了。
# y2 u! e$ w( P8 L  x5 b多加点缓冲液离一下再过滤就好了，这是秘诀！

hxf_86

evial 发表于 2011-9-8 16:20 * m5 z0 X; B8 t( r
嘿嘿，你的细胞没有滤过去，还在渣滓里呢，也就是在你滤网里面，200目太大了吧，是纤维组织沉淀下去了。
. [  y! g5 [4 L5 z4 ^0 c' B多 ...

' `  H: u( E% t1 _. O7 |
首先感谢您的帮助！
, F. U/ Q2 ~7 Q4 k不好意思我不太懂，200目太大的话为什么细胞会没虑过去呢？
( O* W) H: a# L$ P2 [& K还有，多加点缓冲液离一下再过滤是什么意思？是不是指用于中止消化的培养基的量要加大？. I2 [6 P4 _, \4 E, M3 M, D1 r

2 `7 D6 ^, l) c5 H. r5 h对了，我还试过培养基中止消化以后（大概一共10ml体积），先不过滤，进行细胞计数，在计数板上还是看不到细胞。; |5 o' a& O# C# f7 ]

* U# E+ \0 C# H谢谢您的热情帮助！

tangyvhuang

什么组织？组织的量跟消化酶的比例是多少？这个跟作用时间有很大关系，我觉得很可能是酶作用不够，没有消化开，

evial

充分剪碎加酶液后看过有细胞下来么？消化后液体里不可能没有细胞，要么就是没消化彻底。消化后液体是不是很稠厚？加个30-40mlPBS去离心，终不终止酶消化无所谓的。做实验每一步都要用心想用眼睛看，去证实。
/ w0 e3 D# s- K) I我们用的是BD小漏斗，70um的，一箱50个近六百元。

hxf_86

tangyvhuang 发表于 2011-9-8 22:32 1 |1 I5 v4 ~5 ^- l/ X
什么组织？组织的量跟消化酶的比例是多少？这个跟作用时间有很大关系，我觉得很可能是酶作用不够，没有消化 ...

- @2 F) H' l4 w% `; G4 k是牙髓组织，应该是结缔组织的一种。至于比例，我还真的没有去算过。请问这位大侠应该怎么算呢？我是用6ml酶消化液，每种消化液的浓度是1mg/ml和2mg/ml。( z* y0 f  `9 i: E
因为我看的protocol是用这个浓度消化1h的，之前几次都好好的，就是最近这几次没有细胞，其他所有条件都是一致的。8 J. h4 D" m8 K5 x9 ~3 I
谢谢！

hxf_86

evial 发表于 2011-9-9 10:20 5 M$ d% d2 [8 w7 h" J
充分剪碎加酶液后看过有细胞下来么？消化后液体里不可能没有细胞，要么就是没消化彻底。消化后液体是不是很 ...

9 g& s! Q1 v# `7 E# l/ S
感谢您！6 T3 Z* W3 S$ o! k& p# b
我也是用的BD70μm小漏斗，价格一样。
7 z! }. u" h7 R. P' p- @0 G那您觉得是我的细胞都粘在没消化完全的组织块上么？加PBS是为了冲散这些细胞么？紧觉得我需要加长消化时间 or 加大酶的浓度？

evial

总会有一些细胞还在组织块里面消化不干净的，加多少酶液看组织的量多少，反正要浸没不能太稠厚了，时间也是看情况的，要经常观察消化入酶液里的细胞情况。

yinjiqingqq

如果你的protocol 没有问题，那你要看看是不是取样的问题，譬如取样时间过长，或不是低温条件；再有你用的酶是否配制时间过长，已经失活了。

juan880929

首先要先搞清楚是什么组织？要培养的目的细胞是什么，是胎儿的组织还是成体的。如果是成体的，用胰酶消化都很难看见见细胞，何况是比胰酶作用还要弱地细胞呢？如果培养的是成纤维细胞，成体的可以用组织块贴壁的方法，胎儿的可以用胰酶消化的方法。如果是其他类型的细胞，可以用对应的作用比较 弱地酶过夜消化试一下，祝你好运！