酶消化法 原代培养 无细胞

hxf_86

各位战友，首先感谢！, o6 s' \/ i: O# W/ Y9 D; o
我做原代大概过程：4 m7 x5 }) i4 O% y& g" D3 T
1、取出组织块后，常规清洗，剪刀充分剪碎& n" b) r: N; Z' o" t: C' V5 s* E9 ^
2、然后COL 1+dispase等比例混合消化（浓度分别是2和4mg/ml，总体积3-6ml），50-60min，水浴  i! f- s7 w( U/ R& B& Z
3、含20%FBS的培养基6-9ml中止消化
2 ?' G& [. e3 _; G# C$ U6 X' U/ Z3 f4、200目筛网过滤，500g，5min7 P; O5 e$ k7 o" N( m3 U
离心结束后，可以看到明显的沉淀，但是细胞计数板计数，镜下观察没有细胞。
$ J. ]: F, I, y' p- l7 j( h& \请问是什么问题？谢谢！. E( H1 I" r( e( R# \) M& Y

evial

嘿嘿，你的细胞没有滤过去，还在渣滓里呢，也就是在你滤网里面，200目太大了吧，是纤维组织沉淀下去了。& S: D. y  X/ @3 G" r
多加点缓冲液离一下再过滤就好了，这是秘诀！

hxf_86

evial 发表于 2011-9-8 16:20
9 m/ `  C7 y% W" d, w4 b' q; o" s" U嘿嘿，你的细胞没有滤过去，还在渣滓里呢，也就是在你滤网里面，200目太大了吧，是纤维组织沉淀下去了。
2 R2 q" a7 H: S( F  _& _: y多 ...

' a* ]$ ^& S/ Q首先感谢您的帮助！
& ]( e0 I! h& G& k: H- K不好意思我不太懂，200目太大的话为什么细胞会没虑过去呢？7 W3 D: C  C/ O
还有，多加点缓冲液离一下再过滤是什么意思？是不是指用于中止消化的培养基的量要加大？
( E' V# Y. A5 S; |& A& ]( p. e+ `4 [
对了，我还试过培养基中止消化以后（大概一共10ml体积），先不过滤，进行细胞计数，在计数板上还是看不到细胞。
4 ?: q& i+ {. I" j
1 o4 X+ T; d  c+ S6 r0 m谢谢您的热情帮助！

tangyvhuang

什么组织？组织的量跟消化酶的比例是多少？这个跟作用时间有很大关系，我觉得很可能是酶作用不够，没有消化开，

evial

充分剪碎加酶液后看过有细胞下来么？消化后液体里不可能没有细胞，要么就是没消化彻底。消化后液体是不是很稠厚？加个30-40mlPBS去离心，终不终止酶消化无所谓的。做实验每一步都要用心想用眼睛看，去证实。; q" \3 W$ @" X& [5 c/ R. x$ y
我们用的是BD小漏斗，70um的，一箱50个近六百元。

hxf_86

tangyvhuang 发表于 2011-9-8 22:32 " s1 X. K! y  w0 i/ ~6 U9 }3 R
什么组织？组织的量跟消化酶的比例是多少？这个跟作用时间有很大关系，我觉得很可能是酶作用不够，没有消化 ...

4 ?+ ]: X$ R4 \  M3 {" k
是牙髓组织，应该是结缔组织的一种。至于比例，我还真的没有去算过。请问这位大侠应该怎么算呢？我是用6ml酶消化液，每种消化液的浓度是1mg/ml和2mg/ml。
9 x- x: U6 ]5 {* ?/ h  H% q9 }( R因为我看的protocol是用这个浓度消化1h的，之前几次都好好的，就是最近这几次没有细胞，其他所有条件都是一致的。
, P' q# {6 v+ G5 z1 g谢谢！

hxf_86

evial 发表于 2011-9-9 10:20 ! M5 p- e, O& p8 Z! h
充分剪碎加酶液后看过有细胞下来么？消化后液体里不可能没有细胞，要么就是没消化彻底。消化后液体是不是很 ...

( a2 E, z0 K% S4 Y# b! ?* {感谢您！
9 T& @9 x# N1 l. \我也是用的BD70μm小漏斗，价格一样。
. }9 P4 \9 {: X. W  S' W) d! @- _3 M那您觉得是我的细胞都粘在没消化完全的组织块上么？加PBS是为了冲散这些细胞么？紧觉得我需要加长消化时间 or 加大酶的浓度？

evial

总会有一些细胞还在组织块里面消化不干净的，加多少酶液看组织的量多少，反正要浸没不能太稠厚了，时间也是看情况的，要经常观察消化入酶液里的细胞情况。

yinjiqingqq

如果你的protocol 没有问题，那你要看看是不是取样的问题，譬如取样时间过长，或不是低温条件；再有你用的酶是否配制时间过长，已经失活了。

juan880929

首先要先搞清楚是什么组织？要培养的目的细胞是什么，是胎儿的组织还是成体的。如果是成体的，用胰酶消化都很难看见见细胞，何况是比胰酶作用还要弱地细胞呢？如果培养的是成纤维细胞，成体的可以用组织块贴壁的方法，胎儿的可以用胰酶消化的方法。如果是其他类型的细胞，可以用对应的作用比较 弱地酶过夜消化试一下，祝你好运！