酶消化法 原代培养 无细胞

hxf_86

各位战友，首先感谢！$ q8 M# E4 H3 d  U$ U, Z" x
我做原代大概过程：. t) K1 v' Z/ ?1 u. T% E
1、取出组织块后，常规清洗，剪刀充分剪碎' r3 z6 ]" l0 P  B
2、然后COL 1+dispase等比例混合消化（浓度分别是2和4mg/ml，总体积3-6ml），50-60min，水浴
* V* y; F% z2 v( }* W, @. z' z  O3、含20%FBS的培养基6-9ml中止消化
! E- K( \$ M/ Q9 W4、200目筛网过滤，500g，5min
, A- a+ J; @: S! d* m. H# _. F离心结束后，可以看到明显的沉淀，但是细胞计数板计数，镜下观察没有细胞。9 k& b2 H- l( b0 o4 @5 ^% u6 \; t
请问是什么问题？谢谢！
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evial

嘿嘿，你的细胞没有滤过去，还在渣滓里呢，也就是在你滤网里面，200目太大了吧，是纤维组织沉淀下去了。
2 _- v- l# C6 l9 |多加点缓冲液离一下再过滤就好了，这是秘诀！

hxf_86

evial 发表于 2011-9-8 16:20
  g, N# _  b6 s. Z嘿嘿，你的细胞没有滤过去，还在渣滓里呢，也就是在你滤网里面，200目太大了吧，是纤维组织沉淀下去了。. b# s2 F! d" v% ^. P$ a5 @9 k
多 ...

  i) G( u. O8 f& A# A首先感谢您的帮助！
0 K6 m% b% N0 c7 l2 ?; S8 L# @' w不好意思我不太懂，200目太大的话为什么细胞会没虑过去呢？
3 U2 ^$ ^2 o& n2 F1 z( F  o8 q还有，多加点缓冲液离一下再过滤是什么意思？是不是指用于中止消化的培养基的量要加大？
. {2 W$ g* k4 e0 c$ [9 s! p
% L. A. K: x  v2 E$ H5 |对了，我还试过培养基中止消化以后（大概一共10ml体积），先不过滤，进行细胞计数，在计数板上还是看不到细胞。/ v" m0 _1 c/ N% Q

+ C+ G$ Q, D3 L/ F; Q9 B, C; z$ a谢谢您的热情帮助！

tangyvhuang

什么组织？组织的量跟消化酶的比例是多少？这个跟作用时间有很大关系，我觉得很可能是酶作用不够，没有消化开，

evial

充分剪碎加酶液后看过有细胞下来么？消化后液体里不可能没有细胞，要么就是没消化彻底。消化后液体是不是很稠厚？加个30-40mlPBS去离心，终不终止酶消化无所谓的。做实验每一步都要用心想用眼睛看，去证实。
  b* {& V4 q+ d我们用的是BD小漏斗，70um的，一箱50个近六百元。

hxf_86

tangyvhuang 发表于 2011-9-8 22:32 3 v" X7 Y8 x$ H& q
什么组织？组织的量跟消化酶的比例是多少？这个跟作用时间有很大关系，我觉得很可能是酶作用不够，没有消化 ...

8 m% J, _% X! L) q; d; ~" L
是牙髓组织，应该是结缔组织的一种。至于比例，我还真的没有去算过。请问这位大侠应该怎么算呢？我是用6ml酶消化液，每种消化液的浓度是1mg/ml和2mg/ml。
  r6 X4 Q/ Q, d7 H, Q( u因为我看的protocol是用这个浓度消化1h的，之前几次都好好的，就是最近这几次没有细胞，其他所有条件都是一致的。, M& I8 ^$ K2 D
谢谢！

hxf_86

evial 发表于 2011-9-9 10:20 3 {' [: t6 R; d( q4 U$ s1 y" \
充分剪碎加酶液后看过有细胞下来么？消化后液体里不可能没有细胞，要么就是没消化彻底。消化后液体是不是很 ...

! D1 l+ W1 Q7 n- _3 {7 O( y% p
感谢您！$ q" P5 ]2 D, x) ~
我也是用的BD70μm小漏斗，价格一样。; R' j1 G2 I' E, l
那您觉得是我的细胞都粘在没消化完全的组织块上么？加PBS是为了冲散这些细胞么？紧觉得我需要加长消化时间 or 加大酶的浓度？

evial

总会有一些细胞还在组织块里面消化不干净的，加多少酶液看组织的量多少，反正要浸没不能太稠厚了，时间也是看情况的，要经常观察消化入酶液里的细胞情况。

yinjiqingqq

如果你的protocol 没有问题，那你要看看是不是取样的问题，譬如取样时间过长，或不是低温条件；再有你用的酶是否配制时间过长，已经失活了。

juan880929

首先要先搞清楚是什么组织？要培养的目的细胞是什么，是胎儿的组织还是成体的。如果是成体的，用胰酶消化都很难看见见细胞，何况是比胰酶作用还要弱地细胞呢？如果培养的是成纤维细胞，成体的可以用组织块贴壁的方法，胎儿的可以用胰酶消化的方法。如果是其他类型的细胞，可以用对应的作用比较 弱地酶过夜消化试一下，祝你好运！