酶消化法 原代培养 无细胞

hxf_86

各位战友，首先感谢！* i, k) ]# S( h
我做原代大概过程：" l# b" R) H& U" A, a
1、取出组织块后，常规清洗，剪刀充分剪碎
5 i2 U% o+ ?3 s6 N+ `2、然后COL 1+dispase等比例混合消化（浓度分别是2和4mg/ml，总体积3-6ml），50-60min，水浴
4 h& [2 P- a1 }' `- \% }' P- G0 n+ }, x3、含20%FBS的培养基6-9ml中止消化8 ?, O7 P8 K. S
4、200目筛网过滤，500g，5min# b' P. j" ~1 @7 l
离心结束后，可以看到明显的沉淀，但是细胞计数板计数，镜下观察没有细胞。! H4 Z' f$ p  T5 }# \
请问是什么问题？谢谢！
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dandan9230

酶的浓度，时间都要摸索。

juan880929

回复 hxf_86 的帖子+ p& Y, k: H. Q7 n
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可以试一下过夜消化

juan880929

首先要先搞清楚是什么组织？要培养的目的细胞是什么，是胎儿的组织还是成体的。如果是成体的，用胰酶消化都很难看见见细胞，何况是比胰酶作用还要弱地细胞呢？如果培养的是成纤维细胞，成体的可以用组织块贴壁的方法，胎儿的可以用胰酶消化的方法。如果是其他类型的细胞，可以用对应的作用比较 弱地酶过夜消化试一下，祝你好运！

yinjiqingqq

如果你的protocol 没有问题，那你要看看是不是取样的问题，譬如取样时间过长，或不是低温条件；再有你用的酶是否配制时间过长，已经失活了。

evial

总会有一些细胞还在组织块里面消化不干净的，加多少酶液看组织的量多少，反正要浸没不能太稠厚了，时间也是看情况的，要经常观察消化入酶液里的细胞情况。

hxf_86

evial 发表于 2011-9-9 10:20 1 D" `8 Z9 Y& p( s% M# x# O- b# V
充分剪碎加酶液后看过有细胞下来么？消化后液体里不可能没有细胞，要么就是没消化彻底。消化后液体是不是很 ...

# z) h& `& Y* |' X# f9 W
感谢您！
+ R3 g' _# _3 T1 k7 l8 V$ k我也是用的BD70μm小漏斗，价格一样。5 t9 C+ _4 Q1 T- D1 O) l* Y
那您觉得是我的细胞都粘在没消化完全的组织块上么？加PBS是为了冲散这些细胞么？紧觉得我需要加长消化时间 or 加大酶的浓度？

hxf_86

tangyvhuang 发表于 2011-9-8 22:32
4 i. g9 O& u- o7 c, S) f4 t  l什么组织？组织的量跟消化酶的比例是多少？这个跟作用时间有很大关系，我觉得很可能是酶作用不够，没有消化 ...

9 Z: i, e. f- i" y- _  g' A" K
是牙髓组织，应该是结缔组织的一种。至于比例，我还真的没有去算过。请问这位大侠应该怎么算呢？我是用6ml酶消化液，每种消化液的浓度是1mg/ml和2mg/ml。8 T$ e) m8 X5 q/ R# @$ h- t, P8 R' w) n
因为我看的protocol是用这个浓度消化1h的，之前几次都好好的，就是最近这几次没有细胞，其他所有条件都是一致的。1 K' U/ H3 ~0 Y& _. y1 |
谢谢！

evial

充分剪碎加酶液后看过有细胞下来么？消化后液体里不可能没有细胞，要么就是没消化彻底。消化后液体是不是很稠厚？加个30-40mlPBS去离心，终不终止酶消化无所谓的。做实验每一步都要用心想用眼睛看，去证实。# A6 I$ a( E( `2 Q2 D/ Y! a1 O
我们用的是BD小漏斗，70um的，一箱50个近六百元。

tangyvhuang

什么组织？组织的量跟消化酶的比例是多少？这个跟作用时间有很大关系，我觉得很可能是酶作用不够，没有消化开，