ips诱导求助

ada800515

最近一直在做ips诱导，都将近一年了，一直没有结果，非常着急，能不能有明白人指点一下啊？我用逆转录病毒，感觉病毒包装还可以，但就是没有结果。不知道还没有别的影响因素啊

yuyan

回复 遗云射月 的帖子. x5 c* ]& O& h4 n

/ e4 O: m: ]8 A' k( j做一个平行对照，包装时同时包装一个带GFP荧光的质粒（另外的孔或dish，但是同一批细胞，质粒浓度也相同）。通过计算包装的GFP的病毒滴度，估算没有荧光的病毒滴度。

sizhengliu

回复 juan880929 的帖子
+ Z  a8 |: ?- O
  z! ?5 C) C5 O6 @/ ?: {  r) V学习了！想问：你提到的“携带EGFP基因的病毒”是指不带因子只带EGFP的空载病毒吗？

inno

lerenina 发表于 2011-10-18 11:50
% v' g3 E( |- M6 @今天第六天，刚刚分到了feeder上。分之前的被诱导的细胞已经长的很密了，看不出形态有什么变化，看来我这次 ...

0 o2 c" X4 `7 n% i! R建议不要多高的接种密度，因为筛选的时间较长，有时候长达20多天。如果是非阳性的细胞过度生长，对形成克隆还是有很大影响的。如果是原来感染效率不高的情况下，如部分荧光强，部分弱的情况下，可以根据荧光考虑用细胞刷挂掉非阳性部分，再消化铺板。总之要尽量提高阳性细胞的接种比例。

inno

“一般感染后一到两天就可以看到MEF细胞有明显的形变，具体说来就是伸出的触角回缩，细胞变小变圆，再过几天细胞开始形成克隆集落，ips基本上就诱导成功一半了，剩下的就是继续培养了。如果前期看不到这些形变发生，就趁早丢掉不要再养了，免得浪费培养基。”$ X2 T/ w, u, e5 X$ D2 P! f0 h! n

5 j2 i4 j9 W" k% |, y9 a从我个人实验中来看，一般很少能几天就看到细胞形成克隆集落的。短则2周以内，长则3周以上的情况都有，这个不能一概而论。因为诱导过程中涉及影响因素过多，如几因子，什么病毒体系诱导，GFP效率，不用细胞来源，不用的培养基体系（这中间包括加入的各种小分子，连FBS和KSR都会有所不同），甚至feeder的情况都有可能影响实验，等等。建议还是多参考对应的文献，从实际问题出发，找出到底是哪个环节出了问题。

lerenina

今天第六天，刚刚分到了feeder上。分之前的被诱导的细胞已经长的很密了，看不出形态有什么变化，看来我这次感染的不好了。) o) K& }/ G; p! K" Q$ e* @
四种因子的逆转录病毒不是我自己包装的，是从北京华盛公司买的，他们只给了一个滴度，也没有任何检测的方法，感觉真的很悬啊！

christophe

回复 lerenina 的帖子4 F8 b# ?. v5 r+ l

2 X" Z0 j7 Z7 r- H一般的做法是构建一个pMXs-EGFP对照质粒用来看转染和感染的效率，如果GFP的感染效率有百分之七八十左右就完全没有问题了。SKOM本身不带GFP没法直观的观察，但是如果感染效率足够好的话，一般感染后一到两天就可以看到MEF细胞有明显的形变，具体说来就是伸出的触角回缩，细胞变小变圆，再过几天细胞开始形成克隆集落，ips基本上就诱导成功一半了，剩下的就是继续培养了。如果前期看不到这些形变发生，就趁早丢掉不要再养了，免得浪费培养基。

lerenina

回复“ada800515 ”5 I& p1 B, t" |+ I+ h
我的这套就是2006年YAMANAKA的那套，pMXS-kl4，sox2，oct4，cmyc，不带荧光标签。
% ]5 C2 n7 a- j, Z# N- {/ i  K8 @你展示的293T包装的病毒，如果是单一一种感染的话，效果应该不错。但四种一起感染，全部感染上的细胞概率可能会低很多。  Q+ E4 y9 f. z  s' F+ q
直接转293T就行了吗？不用加helper或者其他什么辅助包装质粒了吗？貌似单独293T不具备合成一些病毒外膜蛋白的能力哦。

yangel

ada800515 发表于 2011-9-13 14:46   ^4 I) ?8 n8 e: D
包装后不是很亮的293t细胞7 N9 j# r1 L! T
包装后很亮的293t细胞，想知道上面两个照片的包装效率可以吗？四种质粒中三种是 ...

0 n/ P  Z% a. D下面这个也菜just so so吧，包装效果一般的话，建议浓缩病毒来做。

yangel

lerenina 发表于 2011-9-13 11:22
9 z, H! j# T) j/ m, ?+ j" _9 ^; m" V我也是这个问题，我拿到的一套pMXS的质粒都不带GFP或者RFP什么的，怎么看转染效率及对靶细胞的感染效率呢？

  u5 @; X4 s& S5 n1 Q7 L: q. x$ E免疫荧光染色确认一下感染效率吧！