为什么要测定慢病毒滴度？ - ips专区干细胞之家

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藤椅

发表于 2011-9-25 10:48 |只看该作者

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我想在用病毒载体转染细胞时，进行病毒载体滴度测定就是要知道上清中病毒载体含量多少，如果滴度过低，转染成功率较低，如滴度过高，会导致病毒载体浪费，同时还有可能导致宿主含有过多病毒载体而死亡。

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发表于 2011-9-25 10:49 |只看该作者

回复 huangcong1988 的帖子0 X- P' A  }5 s9 [

有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。9 B6 C- E! t2 \: A  S
1． VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）5 h; W. N3 u1 B) R- T8 \
2． GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）
3． PFU（空斑形成单位）
4． TCID50（50%组织培养感染剂量） . c  f% F9 I8 N8 H* G
不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。' u7 y4 m' s2 Y/ s
2． GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。9 Q- `2 E5 x& S9 U3 K
3． PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。; {" M! H+ Q$ `4 O3 X& B) Q# }
4． TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。

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报纸

发表于 2011-9-25 10:50 |只看该作者

回复 naturalkillerce 的帖子: K* o4 w; b# q4 f* Z) s. `! l

titration of lentivirus& Y" l# v+ n( K" j# ~2 g5 F

1. The day before titration, seed 0.5 × 10^5 293FT cells in 2 ml of DMEM-10 into all wells of a 6-well culture plate, ensuring a uniform spread of cells on the bottom of the wells. Prepare one plate for each vector stock to be titrated. Incubate overnight at 37°C, 10% CO2. 0.5 × 105 cells are seeded to produce 1 × 10^5 cells per well the next day. The number of cells seeded must be accurate because it will be taken into account when calculating the titer.  m: i( H- t: I: |: r9 D
: K0 E, q( z8 l
2. To five wells, add aliquots of the vector to be titrated: use 50 μl and 25 μl of the undiluted stock, and 100 μl, 50 μl and 25 μl of a 1:50 diluted stock (corresponding to 2.0, 1.0, and 0.5 μl of undiluted vector). Do not infect the cells in the last well; these are controls. Incubate 2 days.* G  h6 w! J' b1 A& b
' x7 Q6 \4 @# z
3. A 1:50 dilution is obtained by diluting 5 μl vector into 245 μl DMEM-10. Since the added volumes are small relative to the culture medium (2 ml), total volumes are not corrected.   @! n. E. y( U; J7 {  }, n

4. Before the fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis, remove the culture medium, wash once with 2 ml PBS, and add 500 μl of 0.25% colorless trypsin/0.53 mM EDTA. Incubate 5 min at 37°C. Pipet up and down with a 1000-μl pipet tip to disrupt clumps. Transfer cells to a FACS tube containing 500 μl PBS. Cells will detach after a 5 min treatment with trypsin/EDTA.0 ]0 Q( B: O# ^

5. If desired, an aliquot of the cells can be kept in culture. If the FACS analysis is not done within 1 hr, cells can be fixed in 4% (w/v) paraformaldehyde solution for 30 min and kept for at least 1 week at 4°C.

6. Determine the percentage of GFP-positive cells by FACS analysis.) x* h9 @% D# R$ e7 }

7. Calculate the titer in transducing units (TU)/ml, according to the formula:Vector titer = 1 × 10^5 293FT cells × % of EGFP × dilution factor. For accurate titer calculations, the number of GFP-positive cells in 2 wells infected with 2 consecutive dilutions must be close to the expected 1:2 ratio. This linearity is observed when <15% of the target cells are transduced.

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