文献翻译

vicjaychou

很好，谢谢楼主，学习下翻译细节。很多时候就是感觉看得懂讲不出来啊。

eley

4. 讨论总结
$ K& \9 t  V& a8 H! o% Z     果蝇的先天免疫系统快速大量地产生一系列抗微生物的多肽来应答微生物的入侵[1-4]。先前的实验表明果蝇TAK1是在IKK和JNK通路中PGN诱导抗微生物免疫应答一个关键的调节子[13-15]。本文中，我们已经验证一种TAK1连接蛋白TAB2可以诱导激活NF-κB信号通路。而且，通过使用双链RNA干扰，我们也论证了dTAB2对PGN诱导JNK MAPK的激活和抗微生物多肽Diptericin及攻击素的表达是必须的。( F" }3 W! F+ x2 b# l' N- J
      哺乳动物免疫系统研究表明TAK1的激活是受两种TAK1连接蛋白TAB1和TAB2/3的调控的[19-21]。迄今为止，果蝇中还没有TAB1样蛋白被分离鉴定出来。然而，本文中，我们已经鉴定出果蝇TAB2样蛋白，将其命名为dTAB2。在果蝇体内，dTAB2可以与dTAK1结合，因此dTAB2也可以作为dTAK1连接蛋白起作用。在哺乳动物细胞中，TAB2不仅可以与TAK1结合，还可以与上游调节子TRAF6结合形成TAK1-TAB2-TRAF6复合物[21-26]。TRAF6还有一个起泛素连接酶作用的N-端RING区域，可以与二聚Ub连接酶复合物（包括Ubc13he Uev1A.Mms2）结合来催化TRAF6的K63连接泛素化。TAB2连接到K63连接的多聚泛素化TRAF6的C-端锌指（ZnF）结构上，是TAK1更易被激活。在果蝇中，TAB2也含有C-端保守的锌指结构，该区域的去处导致NF-κB信号通路激活能力的消失。而且，两种TRAF的同源物，dTRAF1和dTRAF2，已经在果蝇体内鉴定出来。其中，只有dTRAF2含有RING区域，当E.coli入侵时，dTRAF2突变子Diptericin和抗菌肽的诱导量降低[34]。然而，dTAB2与多聚泛素化的dTRAF2结合是否会是dTAK1激活更容易还需要进一步研究。" e# d- ~: J  E9 O! L+ }
       在哺乳动物体内，通过TAB2-敲除小鼠和RNAi研究，TAB2的生理学重要性已经被弄清楚了[25,27]。TAB2去除产生的形状与NF-κB、IKK-β和NEMO/IKK缺失小鼠相似。然而，IL-1或TNF诱导的NF-κB和JNK通路激活在TAB2缺失的胚胎成纤维细胞是很正常的现象。最近，另一种哺乳动物TAB2同源物，TAB3已经被鉴定出来。使用RNAi同时去除TAB2和TAB3一直IKK和JNK的激活[25]。迄今为止，果蝇中dTAB2缺失的品种还没有报到过。然而，我们在本文中通过dsRNAi沉默dTAB2抑制PGN诱导的JNK激活和抗菌多肽dipericin和attacin基因的表达，这两种多肽是在革兰氏阴性菌病原体刺激IMD信号通路所产生的（Fig.7）。因为dTAB2可以和dTAK1结合，所以TAB2被人为是TAK1的一个关键的调控因子，实验与以往文献记载相一致，就是果蝇的TAK1对由PGN激活的NF-κB和JNK MAPK信号通路是必须的[13-15]。考虑到dTAB2会与dTAK1结合，并且它的哺乳动物同源物TAB2可以激活TAK1，所以实验中PGN刺激的dTAB2的生理功能也是由TAK1调控的。另一方面，山梨醇或NaCl诱导 JNK激活对dTAB2沉默的果蝇细胞是没有伤害的，这与Chen等人的研究室一致的，也就是通过dsRNAi封闭TAK1不会抑制JNK的激活。JNK的激活时受四种MAP3Ks调控的。3 d  \" v# E# [, R; Y
      与IKK和JNK激活过程中TAB2和TAK1的作用相比，TAB2和TAK1在p38 MAPK激活中的作用还不明确。TAK1可以直接磷酸化并激活MKK6（在体外的一种p38的MAP2K）[19,21]。然而，在TAB2沉默的果蝇细胞中，我们还没有发现PGN诱导p38激活过程总任何重大的缺陷。而且，我们以前的研究也证实了PGN诱导p38激活在TAK1沉默细胞中式很正常的[32]。以上研究结果说明，TAK1以及它的结合蛋白TAB2不会参与到PGN刺激的p38激活过程中。在以往文献中记载，由TAK1作用的p38激活过程可能是由于另一种TAK1激活复合体TAB1蛋白引起的[35,36]。
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eley

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4 Q5 L  S4 Z7 `; T: ~3. 结果分析9 r7 q2 j) Q. O1 R5 A/ ~8 G5 o0 |3 B
3.1 dTAB2的鉴定& Z5 L4 \- N, C( B2 N# A. Z+ p9 Y$ g
为了从果蝇中分离鉴定出TAB2样蛋白，我们比较了与人体TAB2相关的果蝇基因组数据库。果蝇中的TAB2相关蛋白我们命名为dTAB2，位于果蝇数据库的CG7417座位且是一个ORF1。我们接下来设计出引物并且通过RT-PCR从果蝇S2细胞整个RNA扩增出编码dTAB2的cDNA（Fig.1A）。dTAB2基因被完全测序并且登记在GeneBank上，编号为DQ025530。dTAB2预测包含有831个氨基酸残基。与哺乳动物TAB2/3，dTAB2相似，dTAB2在N-末端也包含有泛素连接区（N-CUE）和C-末端的高度同源的锌指（ZnF）结构（Fig.1B）。
2 l& y" D" ^# o6 [$ L4 \4 q  J3.2 在体内dTAB2与dTAK1结合
" p. Q3 d* Z, R( _! ]1 U. I* `   最初研究表明哺乳动物TAB2/3可以通过C-端区域与TAK1作用，TAK1-TAB2-TRAF6复合物对IL-1激活JNK和NF-κB是至关重要的[20,25,26]。我们检测了果蝇TAB2是不是也会与dTAK1进行连接。编码HA-dTAK1和FLAG-dTAB2的质粒被转入HEK-293细胞，利用连接在琼脂糖珠上的anti-FLAG抗体（M2）dTAB2从细胞溶解物中免疫共沉淀析出。如Fig.2A所示，在dTAK1存在条件下dTAB2被免疫共沉淀。反之亦然，在dTAK1免疫共沉淀中，dTAB2也被检测出来（Fig.2B）。这些结果证明在体美dTAB2可以和dTAK1连接。9 J1 \% i' X0 `+ Z/ g5 Q

* ~2 b- x3 S! g# ?/ t3.3 JNK和NF-κB信号通路被TAB2激活
. ~7 x- |- S+ s4 s: w     哺乳动物TAB2/3与TAK1连接会导致JNK和NF-κB信号通路的激活[13,14,20,25,26]。因为我们已经发现dTAB2可以和dTAK1结合，所以接下来我们检测dTAB2是不是也可以诱导TAK1和JNK的激活。如Fig.3A和Fig.3B所示，通过检测MKK6的过磷酸化和JNK的激活，dTAB2的过表达可以诱导TAK1的活化。
/ L* E4 S' [: R. q/ ]同时，dTAB2的过表达可以诱导IκB的磷酸化和退化（Fig.4A）。而且，当dTAB2和NF-κB依赖的荧光素酶报告基因一通转入293细胞时，dTAB2可以在剂量依赖条件下激活报告基因（Fig.4B/Fig.4C）。但是，如果只切除C-端ZnF结构保留N-端的CUE结构会消除dTAB2对NF-κB的激活作用。以上结果显示，dTAB2的功能行使需要C-端ZnF结构。
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3.4 PGN可以使dTAB2诱导JNK激活，但山梨醇和NaCl不能
, T8 h# [0 j9 T* E4 Y    在PGN刺激的情况下，果蝇TAK1对JNK信号通路的激活起到不可替代的作用[13-15]。为了检测dTAB2是否也在PGN诱导JNK激活过程中必不可少，我们进行如下实验，通过RNAi抑制果蝇S2*细胞中dTAB2的表达。加入靶向TAB2的dsRNA，然后通过RT-PCR检测他们的表达，当然RP49的表达不熟影响（Fig.5A）。经过和没有经过dTAB2双链RNA处理的S2*细胞置于商用LPS中。可以明显地观察到LPS不会激活果蝇的IMD通路。与此相反，如果用革兰氏阴性PGN处理可以检测到激活物质的存在[11,12]。细胞溶解物进行Western blot分析，使用anti-phospho-JNK对JNK进行检测，结果如Fig.5B。当dTAB2的表达被抑制后，PGN诱导JNK激活程度下降，这意味着JNK激活来应答PGN刺激通路中，dTAB2是必须的。在相同状态下，我们也检测了p38的激活情况，但是没有发现dTAB2起什么必须的作用（Fig.5B）。此结果与我们原来发现的PGN刺激p38激活中，dTAK1不起作用的情况一致。  m' p, q0 p7 r( Z+ H9 w

$ c# O/ [: Q# n8 \) l7 i; F我们也证实了在山梨醇或NaCl诱导JNK激活情况下，dTAB2是不是也起作用。在果蝇细胞中，沉默dTAB2对山梨醇或NaCl激活JNK通路没有什么影响（Fig.5C/D）。
7 E1 c) ?3 o7 j# Q( j1 u3.5 PGN 诱导抗菌多肽基因的表达需要dTAB2
& n: l7 {0 G5 b5 J4 e# f( F1 Z     经过微生物病原体刺激后，果蝇细胞会快速而大量地产生抗微生物多肽来应答微生物的入侵，果蝇免疫系统中两个长距离的信号通路被激活。革兰氏阴性菌病原体的入侵导致抗菌多肽的产生，比如说攻击素，Diptericin和抗菌肽，可以调控NF-κB转录因子Relish的IKK依赖性激活[10]。受NF-κB激活调控的抗菌多肽基因的表达需要TAK1[14]。为了检测抗菌多糖的产生是否也需要dTAB2，S2*细胞使用dTAB2的双链RNA处理，然后用包含PGN的商用LPS处理多次。两种在IMD通路总典型的多肽Diptericin 和攻击素的mRNA的含量使用实时定量PCR进行检测，Diptericin和攻击素的拷贝数使用RP49进行标准化。结果显示在野生型的果蝇细胞中PGN的刺激可以显著地诱导Diptericin和攻击素的表达，但在dTAB2敲除的S2*细胞中不会（Fig.6A/B）。结果表明，在果蝇细胞的先天免疫应答中，通过NF-κB调控的抗微生物多肽的产生需要dTAB2的参与。
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2. 实验步骤& [1 J* S% _+ y. ?3 H6 U
2.1 分子克隆5 @# q, W) a; O
从果蝇S2*细胞的完整mRNAs中，利用RT-PCR扩增出编码dTAB2的全长度cDNA。然后将TAB2基因插入到N-端具有FLAG标记的pCDNA3.0质粒中。编码dTAK1的全长度cDNA有Jin Mo Park（加利福尼亚大学圣迭戈分校）提供。将dTAK1的cDNA插入到N-端具有HA标记的pCDNA3.0质粒中。/ a& T# z  U4 |# E- H% C
2.2 果蝇细胞的培养与转染, [: b7 K" L* f. Q$ b
    在25℃，S2*细胞在含有10％FBS（GIBCO）的1×Schneider果蝇细胞培养基中培养，并且加入50单位/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素[30]。在加入PGN进行刺激之前，S2*细胞至少与1μM 20-羟基-蜕皮素（Sigma）孵育24小时来诱导分化[31,32]。37℃，空气CO2含量为10%的情况下，HEK-293T细胞在含有10%FBS（GIBCO），1mM L-谷氨酰胺和100单位/ml的盘尼西林/蜕皮素的MEM培养基（Sigma）中。HEK 293细胞使用磷酸钙方法进行转染。
$ R1 p  t9 T0 ~' X; ?8 u8 x& @/ _2.3 PT-PCR和dsRNA合成
* F/ q( I* g/ d& v& j% ?+ I    使用试剂盒（Invitrogen）将S2*细胞的全RNA分离。使用SuperscriptTM RT-PCR单链合成系统（Invitrogen）合成单链cDNA。用于合成dTAB2 dsRNAs的引物序列如下所示，包含一个5’ T4 RNA聚合酶连接位点（TAATACGACTCACTATAGGGAGA），接下来是5’GTTGGTAGCCCACATCCTG3’；另一个是5’GCCCGCACTGAAGACACT3’。这些引物是用来进行敲除效果检测的。PCR程序设定如下：94℃灭活3min，扩增30个循环（95℃45s，55℃45s，72℃1min），最后72℃延伸10min。纯化的PCR产物作为模板使用MEGASCRIPT T7转录试剂盒（Ambion）产生dsRNA。然后dsRNA产物用LiCl沉淀并悬置在DEPC-H2O中。dsRNA在30分钟内慢慢地从65℃冷却到室温。RNA浓缩物在A260下检测并用1%琼脂糖凝胶电泳分析，最后在-70℃保存。% D$ m  n' o9 w
2.4 RNAi
, Y6 u8 ~! U% J0 }& H5 p" @  k" e    像先前的文献[32,33]记载一样进行RNAi。简要介绍：在6孔平板中，1×106 S2*细胞使用不含FBS的1×Schneider果蝇培养基（GIBCO）进行培养。室温下，加入dsRNA，1h后加入含有15%FBS的1×Schneider果蝇培养基（GIBCO）。接着孵育72h使靶mRNA去除。
- ^9 u- p9 j3 [' p2.5 Western blotting和免疫共沉淀3 k6 m6 I# u" w, V# V, z
    S2*细胞与dsRNAs孵育3天后暴露在不同的压力状态下，然后用SDS-PAGE上样缓冲液将其裂解。等量的蛋白进行SDS-PAGE（10%的凝胶）分析，然后转移到硝化纤维膜上。识别磷酸化p38（Biosource），磷酸化JNK（Cell Signaling Technology）和γ-微管蛋白（Sigma）的抗体进行Western blotting。HEK-293T细胞的裂解物使用放射性免疫共沉淀分析缓冲液（150 nM NaCl，20 mM Tris-Cl pH 7.5，1 mM 甘油磷酸酯，0.1% Triton X-100，1 mM Na3VO4，1μg/ml 蛋白酶抑制物）处理，然后分别与连有M2 anti-FLAG抗体的琼脂糖珠和anti-HA琼脂糖珠进行免疫共沉淀，洗脱物进行SDS-PAGE分离，然后转移到硝化纤维膜上，分别用anti-HA和anti-FLAG的抗体（Sigma）进行免疫印迹。- \- i( d: {6 E7 d
2.6 实时定量RT-PCR- R3 l: g! a6 R4 \# K& J3 }
    完整的RNA使用试剂盒（GIBCO）从S2*细胞中分离出来之后用不含RNase的水溶解，然后再用DNase（Promega）处理，完整的RNA使用ReverTraAce反转录酶（Toyobo）和dligo（dT）15引物（Promega）进行发转录反应。单链cDNA作为模板进行实时定量RT-PCT。攻击素A和Diptericin的表达量用SYBR Green Master Mix（Toyobo）检测。热循环状态如下，50℃起始处理2min，95℃10min，接下来是两步法PCR：95℃15s和60℃60s，如此进行40个循环。数据收集和数量计算在ABI PRISM 7900序列检测系统（Applied Biosystems）上处理。PCR特性用PCR产物分子重量进行分析并且没一个点都进行融化曲线分析。每一个样品的攻击素A和Diptericin拷贝数量用rp49标准化。引物序列如下：& J4 a6 Z) r% W
Diptericin5’-GTTCACCATTGCCGTCGCCTTAC-3’，5’-CCCAAGTGCTGTCCATATCCTCC-3’，
/ ^  Y% _0 i# a; Z攻击素，5’-GTGGTGGGTCAGGTTTTCGC-3’，5’-TGTCCGTTGATGTGGGAGTA-3’，
. i% H9 O, b' t7 y4 W# oRp49，5’-AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG-3’，5’-CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG-3’。& ^' d  [& T7 g6 g- x( g9 H8 P
2.7 荧光酶分析
  `% j& n& \* p. Z, a% Y    HEK 293细胞用两个质粒进行转染，其中一个是NF-κB报告质粒pRL-TK（Clontech）。转染48小时后，细胞在室温下溶解15min（被动溶解缓冲液，Promega）。溶解物使用Dual-荧光酶报告基因分析系统（Promega）分析，用光度计（Lumat LB 9507，Germany）进行测量。结果显示三次测量的平均值。
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) g! i0 V& S$ t3 k4 f% Q1、介绍
6 r$ a' k- Q4 [1 L6 e      果蝇的先天免疫系统可以快速大量地产生抗菌多肽来应答微生物的入侵。这种抗微生物多肽基因的激活收到两种远距离信号通路的调控，他们分别是IMD和Toll级联反应。IMD通路通常是由革兰氏阴性菌病原体激活的，此通路导致抗菌性多肽的产生，如攻击素，Diptericin，抗菌肽等。Toll通路识别革兰氏阳性菌和真菌的病原体，促使抗真菌性的多肽产生，例如Drosomycin。两种信号级联反应都需要NF-κB通路的激活来诱导抗微生物多肽基因的转录。果蝇TAK1是一种MAPKKK，对于NF-κB通过革兰氏阴性菌肽聚糖（从革兰氏阴性菌提取的一种商用脂多糖化合物）激活时必须的。RNAi使dTAK1沉默抑制了PGN对IKK和JNK的激活作用，同时果蝇Schneider（S2）细胞抗微生物多肽的产生也降低。而且，果蝇TAK1突变型也进行了抗微生物多肽产量的检测，该突变型对革兰氏阴性菌的感染是非常敏感的。
$ O- ]- ^( N7 M  X$ m* T* z; ^    TGF-β（转移生长因子激活蛋白激酶（TAK1））曾经被认定为一种TGF-β激活的MAPKKK，并且在细胞内对原初免疫细胞因子（例如白细胞介素（IL-1）和肿瘤坏死因子（TNF））的应答起了非常重要的作用。在哺乳动物细胞中，TAK1的激活需要上游激酶复合物的作用，例如TAK1和两种特定的TAK1连接蛋白，TAB1和TAB2。TAB1是TAK1的激活因子，而TAK2是一种受体蛋白，它将TAK1在IL-1信号通路中与上游调控子TRAF6进行连接[19-21]。TAB2位于没有被激活的细胞膜上，一旦细胞被IL-1激活TAB2 就从膜上转移到细胞质中，这样就是TAK1容易与TRAF6结合[22,23]。生物化学研究表明，TRAF6有一个RING区域，这个区域包含有能够使二聚体泛素聚集的泛素连接酶（包括Ubc13，Uev1/Mms2），他们可以催化赖氨酸连接的多聚泛素链的形成[24]。在依赖蛋白酶体的情况下，TAB2/3连接到多聚泛素化的TRAF2或TRAF6上，导致TAK1和IKK的激活。
* R& _) m* C3 R5 n  H     在哺乳动物中，由于肝脏退化和凋亡，TAB2的缺失会导致胚胎致死，这与NF-κB，IKK-β和NEMO/IKK缺失症状相似[27]。然而，通过IL-1和TNF激活NF-κB和JNKMAPK，在TAB2缺失的胚胎成纤维细胞却表现细胞正常生长的现象[27]。最近，这种现象被TAB2的一种同源体TAB3的发现而被证实和解释[25,28,29]。确切地说，TAB2和TAB3同时被RNAi敲除才回导致IL-1和TNF对IKK和JNK激活的抑制，这也就意味着TAB2和TAB3作为IL-1和TNF信号通路上另外的调节子而存在。; y+ M5 ~/ y- S1 z2 [6 Z& a
     与TAB2在哺乳动物细胞中的研究相比，TAB2在果蝇JNK MAPK激活和NF-κB信号通路没有起关键性的作用。在本次研究中，我们已经证实了dTAB2会和dTAK1相连，dTAB2的过表达会导致NF-κB信号通路的激活。而且，通过RNAi对dTAB2的表达进行敲除会显著地降低PGN对JNK的激活和抗微生物多肽的表达，这也就指出在先天免疫过程中TAB2对JNK和NF-κB的激活时必不可少的。
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2 q' o# j" ^+ [' R8 [  U, f, b: w  f6 o1 _: ~% o1 E
        摘要：通过控制JNK和NF-kappaB的免疫激活，TAK1在果蝇先天性免疫应答起了中枢作用。在哺乳动物中，TAK1的激活又是受到两种TAK1连接蛋白TAB1和TAB2的调控，但是在果蝇中，TAB蛋白的免疫应答作用还没有被确定。本文中，我们对果蝇中TAB2样蛋白（dTAB2）进行了鉴定。dTAB2可以与dTAK1进行相互作用，并且可以激活JNK和NF-κB信号通路。而且，我们还发现通过dsRNAi方法沉默dTAB2的表达，肽多糖可以抑制JNK通路的激活，但是NaCl和山梨醇没有这样的抑制效果。dTAB2的沉默对由dTAB2引起的p38通路激活起到巨大封闭作用。以上实验结果显示，dTAB2对JNK和NF-κB信号通路的PGN激活是必须的。
" ]' `) j& ^* u6 @$ ?9 L. j+ I% x& Y    关键词：果蝇  TAB2- n7 e% A, {( {. b8 _4 j
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         Abstract: The TAK1 plays a pivotal role in the innate immune response of Drosophila by controlling the activation of JNK and NF-kappaB. Activation of TAK1 in mammals is mediated by two TAK1-binding proteins, TAB1 and TAB2, but the role of the TAB proteins in the immune response of Drosophila has not yet been established. Here, we report the identification of a TAB2-like protein in Drosophila called dTAB2. dTAB2 can interact with dTAK1, and stimulate the activation of the JNK and NF-κB signaling pathway. Further, we have found that silencing of dTAB2 expression by dsRNAi inhibits JNK activation by peptidoglycans (PGN), but not by NaCl or sorbitol. In addition, suppression of dTAB2 blocked PGN-induced expression of antibacterial peptide genes, a function normally mediated by the activation of NF-kappaB signaling pathway. No significant effect on p38 activation by dTAB2 was found. These results suggest that dTAB2 is specifically required for PGN-induced activation of JNK and NF-kappaB signaling pathway.
# g7 H) J  ]& ?       Keywords: Drosophila TAB2
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