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本帖最后由 eley 于 2011-9-25 12:33 编辑
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3. 结果分析$ v: G% {0 z1 f/ j
3.1 dTAB2的鉴定+ L( Z6 {1 C' g. Q0 O7 J# _
为了从果蝇中分离鉴定出TAB2样蛋白,我们比较了与人体TAB2相关的果蝇基因组数据库。果蝇中的TAB2相关蛋白我们命名为dTAB2,位于果蝇数据库的CG7417座位且是一个ORF1。我们接下来设计出引物并且通过RT-PCR从果蝇S2细胞整个RNA扩增出编码dTAB2的cDNA(Fig.1A)。dTAB2基因被完全测序并且登记在GeneBank上,编号为DQ025530。dTAB2预测包含有831个氨基酸残基。与哺乳动物TAB2/3,dTAB2相似,dTAB2在N-末端也包含有泛素连接区(N-CUE)和C-末端的高度同源的锌指(ZnF)结构(Fig.1B)。2 [ W) h9 U3 z& S( m7 V
3.2 在体内dTAB2与dTAK1结合
5 C# J# ]; G9 q! Q& j" d8 r5 A& Q# ] 最初研究表明哺乳动物TAB2/3可以通过C-端区域与TAK1作用,TAK1-TAB2-TRAF6复合物对IL-1激活JNK和NF-κB是至关重要的[20,25,26]。我们检测了果蝇TAB2是不是也会与dTAK1进行连接。编码HA-dTAK1和FLAG-dTAB2的质粒被转入HEK-293细胞,利用连接在琼脂糖珠上的anti-FLAG抗体(M2)dTAB2从细胞溶解物中免疫共沉淀析出。如Fig.2A所示,在dTAK1存在条件下dTAB2被免疫共沉淀。反之亦然,在dTAK1免疫共沉淀中,dTAB2也被检测出来(Fig.2B)。这些结果证明在体美dTAB2可以和dTAK1连接。2 L3 q! U% u( a
* B+ m7 k0 ~; | y5 Z. s5 C: @ Z1 E3.3 JNK和NF-κB信号通路被TAB2激活
9 q; a4 j+ B3 `% z. X6 j) j! e 哺乳动物TAB2/3与TAK1连接会导致JNK和NF-κB信号通路的激活[13,14,20,25,26]。因为我们已经发现dTAB2可以和dTAK1结合,所以接下来我们检测dTAB2是不是也可以诱导TAK1和JNK的激活。如Fig.3A和Fig.3B所示,通过检测MKK6的过磷酸化和JNK的激活,dTAB2的过表达可以诱导TAK1的活化。
7 k, I6 H5 W4 N" Z) o同时,dTAB2的过表达可以诱导IκB的磷酸化和退化(Fig.4A)。而且,当dTAB2和NF-κB依赖的荧光素酶报告基因一通转入293细胞时,dTAB2可以在剂量依赖条件下激活报告基因(Fig.4B/Fig.4C)。但是,如果只切除C-端ZnF结构保留N-端的CUE结构会消除dTAB2对NF-κB的激活作用。以上结果显示,dTAB2的功能行使需要C-端ZnF结构。* q! k# H9 ]& C1 T: X" I$ l
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1 b' z3 p/ ?+ A8 } C% Y( s j" _3.4 PGN可以使dTAB2诱导JNK激活,但山梨醇和NaCl不能
9 p0 d$ L0 |1 e0 _ 在PGN刺激的情况下,果蝇TAK1对JNK信号通路的激活起到不可替代的作用[13-15]。为了检测dTAB2是否也在PGN诱导JNK激活过程中必不可少,我们进行如下实验,通过RNAi抑制果蝇S2*细胞中dTAB2的表达。加入靶向TAB2的dsRNA,然后通过RT-PCR检测他们的表达,当然RP49的表达不熟影响(Fig.5A)。经过和没有经过dTAB2双链RNA处理的S2*细胞置于商用LPS中。可以明显地观察到LPS不会激活果蝇的IMD通路。与此相反,如果用革兰氏阴性PGN处理可以检测到激活物质的存在[11,12]。细胞溶解物进行Western blot分析,使用anti-phospho-JNK对JNK进行检测,结果如Fig.5B。当dTAB2的表达被抑制后,PGN诱导JNK激活程度下降,这意味着JNK激活来应答PGN刺激通路中,dTAB2是必须的。在相同状态下,我们也检测了p38的激活情况,但是没有发现dTAB2起什么必须的作用(Fig.5B)。此结果与我们原来发现的PGN刺激p38激活中,dTAK1不起作用的情况一致。1 r$ I" l+ {* t: B$ m2 s% r9 L4 F
; Q, n4 P' Z* | H5 W我们也证实了在山梨醇或NaCl诱导JNK激活情况下,dTAB2是不是也起作用。在果蝇细胞中,沉默dTAB2对山梨醇或NaCl激活JNK通路没有什么影响(Fig.5C/D)。8 ~/ |" g7 z) h
3.5 PGN 诱导抗菌多肽基因的表达需要dTAB28 i7 ?$ c9 e. X: I
经过微生物病原体刺激后,果蝇细胞会快速而大量地产生抗微生物多肽来应答微生物的入侵,果蝇免疫系统中两个长距离的信号通路被激活。革兰氏阴性菌病原体的入侵导致抗菌多肽的产生,比如说攻击素,Diptericin和抗菌肽,可以调控NF-κB转录因子Relish的IKK依赖性激活[10]。受NF-κB激活调控的抗菌多肽基因的表达需要TAK1[14]。为了检测抗菌多糖的产生是否也需要dTAB2,S2*细胞使用dTAB2的双链RNA处理,然后用包含PGN的商用LPS处理多次。两种在IMD通路总典型的多肽Diptericin 和攻击素的mRNA的含量使用实时定量PCR进行检测,Diptericin和攻击素的拷贝数使用RP49进行标准化。结果显示在野生型的果蝇细胞中PGN的刺激可以显著地诱导Diptericin和攻击素的表达,但在dTAB2敲除的S2*细胞中不会(Fig.6A/B)。结果表明,在果蝇细胞的先天免疫应答中,通过NF-κB调控的抗微生物多肽的产生需要dTAB2的参与。
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