大家包装的慢病毒滴度是多少（不包括浓缩）

ying

我差不多是10的6左右，浓缩之后基本达到10的8，凑合用～6 e1 a' g, b" q$ l8 U
转录本里面要是有miRNA什么的，会导致包装效率下降，因为有一些本来可以包到病毒里的RNA被裁减碎掉。如果没有会被剪掉的元件的RNA的话，要是比较小的插入片段，估计应该有10的7左右吧。$ t2 }- @; p! H( t/ L8 @! t, s

ying

回复 sj03572001 的帖子# S4 W* t7 q$ X5 ^, W
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我是VSVG, delta-R8.91 和pGIPZ三质粒系统。我不知道是不是invitrogen的，因为是从我们实验室别人那里要的体系。protocol不方便给你原版，因为是别人整理的。但我可以说个大概。就是，用10cm dish 满的293T一盘传4盘（10ml培液），这4盘都不加双抗，培养24小时，大概达到50-80%覆盖率。这时候做个类似于lipo2000的转染，按标准的lipo的protocol转。就是一只管子加optiMEM和lipo，一只管子加potiMEM和质粒（VSVG:R8.91:pGIPZ=1ug:3ug:4ug，对于10cm大盘），之后混合，放置15分钟，再滴加到细胞里。12小时后换液换成有双抗的培液（DMEM加10%血清），之后36小时收一次病毒，再换液，再24小时后收一次。大致流程就这样。我觉得最关键的就是转染效率，建议你用个GFP的质粒先摸转染条件，主要就是lipo加多少，质粒加多少。效率要90%以上GFP阳性才行。
! x& o; b" T: D; y% h2 l- Z, ~0 l: W如果你包装的是shRNA或者miRNA的序列，这种病毒滴度本来就不容易做的高，因为有些RNA自己会被切断，而没法包装成病毒。只有幸存的RNA才会包到病毒里。) |) u$ J, H  Z" L
祝顺利！

ying

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浓缩后加的培养基可以是你转染的对象细胞的培养基呀。如果你足够猛，就直接把这种浓缩过的东东当作培养液加到吸走培液的细胞里，那就浓到了极限了吧～

ying

回复 huangcong1988 的帖子5 |9 A8 _/ t2 g2 [0 s
9 y( X& }2 [. g: E5 _- N* r8 N! S
按这样说来，确实是被稀释了。' [- m" K' \+ k- X$ \' M
不过，通常我是这样认为的:
! @2 m  ^) @7 I# {一开始没浓缩时，假设体积是100毫升，
# X: h- F  z  z7 t& p1 Z6 @浓缩后，变成一个坨坨，
8 a/ ]6 x2 ?& Y1 B* }0 Y把这个坨坨用1毫升的溶液给溶解了，
4 @& X- l3 V/ R3 v' v0 r1 }1 H假设病毒没有损失率，那么就算是“浓缩”了100倍。因此用我的观点看，是“浓缩”了。

ying

回复 salomemao 的帖子) s" Z7 X) i8 L

8 r4 C- Z" s6 i3 i0 o9 f转染三质粒的时候，我们实验室的protocol是不加双抗的，据说双抗会影响我们的体系的转染效率。原因我也不知道。之后十二小时后我们认为质粒已经进到细胞里面了，所以再加上双抗防止污染。

ying

回复 salomemao 的帖子7 g+ u  Z; z7 z- ?* D' B  R, U
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是啊，让你见笑了 ：）

ying

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, x, L. f$ n. e4 N5 Y' E
% v! J8 a1 I4 V  }8 e  K9 w2 {我是用50毫升离心管，PEG6000和浓NaCl来浓缩，低速离心。一次可以离35ml，最后溶在400微升里面，扣除损失，估计浓缩应该在80倍左右。我还用超速离心法浓缩过，那个方法得到的坨坨很少，因为坨坨主要是血清里的蛋白，超离的时候很少下来。超离我是37毫升最后可以溶在大概200微升甚至更少。

ying

回复 salomemao 的帖子4 u/ M9 i6 ~9 a9 ~0 C

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ying

回复 huangcong1988 的帖子3 O: c3 I1 \4 A6 Z( c/ ?
% C2 W, T; O! U; t. F1 m: {
是的。