大家包装的慢病毒滴度是多少（不包括浓缩）

ying

我差不多是10的6左右，浓缩之后基本达到10的8，凑合用～' t6 `3 u, u$ u2 ^1 A) t3 u( K
转录本里面要是有miRNA什么的，会导致包装效率下降，因为有一些本来可以包到病毒里的RNA被裁减碎掉。如果没有会被剪掉的元件的RNA的话，要是比较小的插入片段，估计应该有10的7左右吧。+ I8 O0 i. f( @. T

ying

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6 d4 q' n7 s. V  d) W
我是VSVG, delta-R8.91 和pGIPZ三质粒系统。我不知道是不是invitrogen的，因为是从我们实验室别人那里要的体系。protocol不方便给你原版，因为是别人整理的。但我可以说个大概。就是，用10cm dish 满的293T一盘传4盘（10ml培液），这4盘都不加双抗，培养24小时，大概达到50-80%覆盖率。这时候做个类似于lipo2000的转染，按标准的lipo的protocol转。就是一只管子加optiMEM和lipo，一只管子加potiMEM和质粒（VSVG:R8.91:pGIPZ=1ug:3ug:4ug，对于10cm大盘），之后混合，放置15分钟，再滴加到细胞里。12小时后换液换成有双抗的培液（DMEM加10%血清），之后36小时收一次病毒，再换液，再24小时后收一次。大致流程就这样。我觉得最关键的就是转染效率，建议你用个GFP的质粒先摸转染条件，主要就是lipo加多少，质粒加多少。效率要90%以上GFP阳性才行。# v7 L! F" {# }
如果你包装的是shRNA或者miRNA的序列，这种病毒滴度本来就不容易做的高，因为有些RNA自己会被切断，而没法包装成病毒。只有幸存的RNA才会包到病毒里。
/ w' Z5 d' A: z) t祝顺利！

ying

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浓缩后加的培养基可以是你转染的对象细胞的培养基呀。如果你足够猛，就直接把这种浓缩过的东东当作培养液加到吸走培液的细胞里，那就浓到了极限了吧～

ying

回复 huangcong1988 的帖子% D, V' \8 c7 {% g
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按这样说来，确实是被稀释了。
% m) i( k! X+ H& s) F- A" a不过，通常我是这样认为的:- m# v. s4 E) {. w3 M
一开始没浓缩时，假设体积是100毫升，) ^0 q% M: a9 t# c% M# n; a5 W
浓缩后，变成一个坨坨，
2 c2 Z3 H$ t1 \5 V0 I9 [/ c; n把这个坨坨用1毫升的溶液给溶解了，
7 y* n  j8 h& Q& d假设病毒没有损失率，那么就算是“浓缩”了100倍。因此用我的观点看，是“浓缩”了。

ying

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6 a4 l$ Q% T) i7 \
% ]3 n% L8 h* C" m7 n转染三质粒的时候，我们实验室的protocol是不加双抗的，据说双抗会影响我们的体系的转染效率。原因我也不知道。之后十二小时后我们认为质粒已经进到细胞里面了，所以再加上双抗防止污染。

ying

回复 salomemao 的帖子; O" y0 j  C: z, x" Q

! T, B& N2 f' j) }9 t( U; Q是啊，让你见笑了 ：）

ying

回复 huangcong1988 的帖子* k. s9 m7 [# i6 [2 T1 {& G; p

; u( x. t! _; h+ p: r我是用50毫升离心管，PEG6000和浓NaCl来浓缩，低速离心。一次可以离35ml，最后溶在400微升里面，扣除损失，估计浓缩应该在80倍左右。我还用超速离心法浓缩过，那个方法得到的坨坨很少，因为坨坨主要是血清里的蛋白，超离的时候很少下来。超离我是37毫升最后可以溶在大概200微升甚至更少。

ying

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# C1 r, |- \  N) N( }  s8 |4 ]4 P! x/ t% ]

ying

回复 huangcong1988 的帖子( J  z8 g( r: f
7 q& a- I7 [. s7 N6 z- x# n
是的。