大家包装的慢病毒滴度是多少（不包括浓缩）

runsong

tanguixiang

太不专业了，单位都不提供，或者至少提供一些前提条件啊: ?, c. j/ k. Q: s6 A5 s, N1 e; D
我做钙转10ml/10cm，106IU/ml

ying

我差不多是10的6左右，浓缩之后基本达到10的8，凑合用～
3 }% D* ?' \4 O0 |转录本里面要是有miRNA什么的，会导致包装效率下降，因为有一些本来可以包到病毒里的RNA被裁减碎掉。如果没有会被剪掉的元件的RNA的话，要是比较小的插入片段，估计应该有10的7左右吧。& b4 v. X+ o7 W% W; h2 ^' |

sj03572001

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: }# E" L0 s3 d6 [7 O! e  k' F
$ F) H* E9 K5 v$ C) j, ?你好，我之前包的病毒滴度总是很低，我们实验室以前没有师兄师姐做过，我刚开始尝试，不知您能发给我一份你的Protocol 吗？我们实验室用的是Invitrogen的系统（PL1，PL2，PL-VSVG)

ying

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$ V" {; v3 b8 P1 [4 e+ M( d9 k7 `( V4 W
3 R; k) o+ k4 U& }1 B* w我是VSVG, delta-R8.91 和pGIPZ三质粒系统。我不知道是不是invitrogen的，因为是从我们实验室别人那里要的体系。protocol不方便给你原版，因为是别人整理的。但我可以说个大概。就是，用10cm dish 满的293T一盘传4盘（10ml培液），这4盘都不加双抗，培养24小时，大概达到50-80%覆盖率。这时候做个类似于lipo2000的转染，按标准的lipo的protocol转。就是一只管子加optiMEM和lipo，一只管子加potiMEM和质粒（VSVG:R8.91:pGIPZ=1ug:3ug:4ug，对于10cm大盘），之后混合，放置15分钟，再滴加到细胞里。12小时后换液换成有双抗的培液（DMEM加10%血清），之后36小时收一次病毒，再换液，再24小时后收一次。大致流程就这样。我觉得最关键的就是转染效率，建议你用个GFP的质粒先摸转染条件，主要就是lipo加多少，质粒加多少。效率要90%以上GFP阳性才行。0 T; D2 |7 a, e4 ~* e: m
如果你包装的是shRNA或者miRNA的序列，这种病毒滴度本来就不容易做的高，因为有些RNA自己会被切断，而没法包装成病毒。只有幸存的RNA才会包到病毒里。" t8 f3 _1 N7 [% H# Z0 x. z; g
祝顺利！

sj03572001

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5 H" T. Y. I9 \9 u, R* B3 l  _; m" z1 s( _  n9 ?; i- {% c. i
谢谢，我们的系统不一样，不过你的建议很有用哦

huangcong1988

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$ R! i8 P7 Z% J$ \2 h2 [* F& S( w6 M8 |+ j/ f/ k" A
我的也是差不多10的6，浓缩后差不多浓缩100倍，但是浓缩后还要加入一定体积的培养基啊，这样不是等于又把病毒给稀释了么？

ying

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+ h9 M+ }2 h2 w2 }% Q$ T$ y5 Y! F7 G# u# g# b
浓缩后加的培养基可以是你转染的对象细胞的培养基呀。如果你足够猛，就直接把这种浓缩过的东东当作培养液加到吸走培液的细胞里，那就浓到了极限了吧～

salomemao

回复 ying 的帖子. s6 I* d! c& H+ b  b

& ~, g, T! K" C5 z5 ~弱弱的问一句，为什么要在12小时后加入双抗的培养基呢？是你们本来养细胞的时候就是用双抗的培养基，还是转染后这样加的呢？谢谢

huangcong1988

回复 ying 的帖子4 ~9 G+ a# x0 b  s9 M

" x' D' J' s1 A2 d不是，我的意思是说，在你浓缩完病毒后，倒掉上清，底下沉淀里面加新鲜培养基，加了培养基之后把沉淀吹打混匀，然后再用来感染细胞，可能我没有表述清楚吧，我是说，加了培养基后，病毒不就被稀释了么？