慢病毒收集的问题

huangcong1988

我在转染之后24h收集慢病毒上清，然后提RNA，反转录，能扩得目的片段，但是提了RNA直接跑胶，没看到带，是浓度很低么？而且有个问题是，转染后一般多长时间收集病毒上清？期间需要给细胞换液么（比如说转染24h，或者48h之后）？我24h收集了病毒上清后，我又直接加培养基直接再过24h收集上清，这算48h么？

gact

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8 ]# C. p6 J% [4 R
我很想知道你用多少  量的上清做的RNA抽提？
" P, v2 w/ w' D' Z
2 L- K# m' |2 u: xRNA抽提是用什么样子的试剂盒？
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huangcong1988

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, ]! [# _. J4 N3 J7 K. l
RNA提取可以用试剂盒，也能直接用trizol，我用400ul的上清，你知道转染多少小时收集慢病毒上清效果比较好么？还有中间需要换液么？

naturalkillerce

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+ J3 [0 o6 D9 W2 p& j+ a7 E9 a$ u' L
, f# C# w% [$ I7 H6 J* w5 B在提取前可以测量一下慢病毒的滴度，根据慢病毒滴度来决定需要多长时间来收集上清。既然RT-PCR能够扩增到目的片段，说明慢病毒RNA存在。之所以没看到带，很可能是RNA提取量本身就少，再加上提取RNA过程中内源性RNase(如果加内源性RNase抑制剂的话，宿主细胞也可能会产生RNase)和外源性RNase(很多细菌会产生RNase，所以提取RNA时，所有相关接触RNA的设备和溶液应保持无菌状态)的降解，最后就自然看不到了。所以可以通过测量病毒滴度来衡量何时收集慢病毒。另外在提取时，千万注意RNase防止对RNA的降解作用。) S& d! {4 S0 s, `$ [  V
5 H* O! q! ]: s" C
补充内容 (2011-10-25 23:23):
' V. Q9 M) T) L- Y. E宿主细胞也会产生RNase，所以提取时应当加一些RNase抑制剂。

huangcong1988

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' F7 m- w2 h5 z- i+ l( K; ]: J; Y, R6 k  [' k, H' c& l
我是提了RNA然后反转录，然后测慢病毒滴度的，我的质粒不带荧光，所以只有通过定量来确定慢病毒滴度，你说让我在提取之前测慢病毒滴度测定，怎么测？而且我也不是做RT-PCR扩增到目的片段的，只是用普通PCR就扩得的

naturalkillerce

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naturalkillerce

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) S0 M& h- c, Y5 T, S% |9 Q3 P
5 q4 c( P8 x& O6 I" E, X! d$ a" P对啊，这就有些不靠谱啊，若是病毒滴度过低，用RT-PCR检测当然可以，因为这种方法只需引物设计比较好的话，可以扩增含量极低的RNA片段。只是提取后才能用RT-PCR检测，但是如果滴度过低的话，后续实验如何进行？所有最好的方法就是实验前测量滴度，可参照的方法就是点杂交测量病毒滴度的方法。: F4 K9 [5 g0 R5 U6 N
1 D, b; D' c- {! b. b
补充内容 (2011-10-26 08:51):0 w, l; }/ _# Y- l
所以最好的方法就是实验前测量滴度，可参照的方法就是点杂交测量病毒滴度的方法。

christophe

回复 huangcong1988 的帖子0 x: A6 |2 f$ _, i, h

- j6 {  M- Q) ]一般是转染后8-12h换液，然后转染后48h收集病毒上清，期间不用换液。转染后24小时收集病毒有些早，病毒才刚刚开始产生。

huangcong1988

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4 b4 b& [, B! W- a/ I! X, f# Y% k& Z  e0 _6 @  ?1 F' k5 T9 Y% ~; ~; T
谢谢，但是中间不换液，细胞液全黄了，而且细胞没了营养怎么办呢？
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christophe

回复 huangcong1988 的帖子& j+ u- u, F% {

+ E4 [( O( V; S' a6 Z  P- J没事的，细胞就只能受点委屈了，只有这样才能富集足够多的病毒。