RNA变性胶琼脂糖电泳问题求教，条带弥散严重

7ubo

7 l" X% y1 D$ |% K* |! Z, h
: I( I6 B* t$ G  r6 y- L2 Y最近跑RNA变性胶琼脂糖电泳的时候条带弥散严重，拖带严重，不同泳道迁移速率参差不齐。其中一部分是刚提出来的，应该不是降解造成的。6 N+ l" |5 C7 @6 B$ A7 S9 a$ i
实验中使用的是DEPC处理过的水来配制溶液。胶和电泳缓冲液的配方分别如下：  U! r8 G5 V" M* z& h

2011-11-3 22:38 上传

下载附件 (48.93 KB)

2 p3 b2 ]5 ~: S( K, c4 j
10XMOPS ：# ^9 t3 U- y1 p* S7 Z
Mix 0.2M MOPS, pH 7.0, 50 mM sodium acetate and 1 mM EDTA& v. b5 Q# W6 i; v# N6 a2 @; V: n
Formaldehyde gel：" |( v/ a: ~2 ~
Mix 1.8 g of agarose in 130.5 ml of DEPC water and boil in a microwave. Let it cool down to B60 1C, and then add 15 ml
! q; ~) {6 S5 {: g2 ?" @' qof 10 MOPS and 4.5 ml of formaldehyde solution (37% (vol/vol)) and fill the apparatus. Insert the comb and allow the gel to
$ r& ?& n' ]% m3 i- ?solidify for 40 min.! P9 N: E4 z9 V- s: b9 \  U
Electrophoresis buffer：9 K! `4 `( c8 X) a7 j
1XMOPS
- _) T) e  }0 B- v; V2 e8 k  NRNA loading dye/buffer:2 w$ e: y# A7 \1 ]& X8 }
50% 去离子甲酰胺
! I, }- [) a1 \20% 甘油% |. k& Z! y/ D. L" b
20% 甲醛" ]+ c, F6 g8 e# T
10% 10XMOPS
7 w6 ~$ j$ F: i& ]5 U0.025% 溴酚蓝
+ P6 m6 V: Z! }2 }; @: W- n* K) J0.025% 二甲苯蓝 FF
0 r6 I' v/ h& v5 S7 r, @5 S' q30ug/ml EB

tangyvhuang

组织的RNA吗？应该是都降解了18s都大了，( ^# L! M: t* t2 J/ m
配方都没有问题，对于buffer有多种配方，但是都差不多，楼主这个配方我有用过。! }& B" O) @! W& ^. {$ L1 h
应该是还是在提取过程中降解了，看上样空干净，没有dna污染，如果浓度测得准确的话，相同ug上样跑成这样子降解了都。
) I1 V' ~" x) d1 n$ T建议楼主，新换buffer，操作时在严格一些看看吧，

dahui

降解完全——鉴定完毕
; P6 v9 j6 t4 z: |& c6 ?9 A建议重新提过。

274996064

我觉得电泳的时间不要太长了 ，要不也会降解

huangcong1988

想知道楼主用什么提的？是试剂盒还是TRIZOL？, W/ W9 A  }/ h9 J4 k/ B& `
不同的提RNA的方法对于RNA的降解程度是不一样的，trizol提的量比较大，但是由于操作所需要的时间比较长，所以用trizol提RNA很容易降解了。  k: |2 z. Q3 j5 I) O. p9 }
用试剂盒提时间短，RNA能比较完整，但是RNA浓度一般不会很高，不过做一般的实验，这样的浓度应该能够满足要求8 e; L, E$ i3 Y6 p) H
而且现在也有TRIZOL的试剂盒，可以试试
5 i; M' g3 ]' e9 A1 n7 ]* J8 S& w补充一点就是，楼主您最好注明提的是组织样还是细胞样

827914734

看图应该是降解，估计还是RNA提取中的问题。
9 x% s* x; {& s& t用Trizol提RNA效果即可，Trizol量要够，另外在操作过程中要注意低温，尤其离心时，注意操作，结果应该会好很多