带有feeder的IPS的传代问题

sarah19860420

今天给IPS传代，结果用胶原酶IV（1mg/ml）消化了8分钟的时候，有小的克隆有卷起来的趋势，结果消化了13分钟的时候发现大的克隆仍然没有动，而有两个小克隆已经飘了起来，所以弃去胶原酶iv。用1ml枪头吹打，结果就是不见大克隆从MEF上分离开来。最后不得已又重新消化了一次，10分钟左右，情况依旧，就用大枪头猛烈的吹，出了很多泡泡。我想问为什么IPS消化那么久都没有下来呢。细胞太老了？还是其他原因呢。
; y1 }' [4 x& {* o$ j( ]7 O3 Y3 QIPS在消化之前需要用DPBS洗一次吗，还是DF12？我看protocol上面说消化总的时间最好不要超过15min。是因为可能会造成细胞分化吗？新手第一次做实验，实在是很纠结啊。

sarah19860420

脱落下来的MEF会不会影响克隆的贴壁。因为未完全把克隆和MEF分离。

fananran2003

最好还是用PBS洗一遍胶原酶iv消化的时间稍微长一些也没什么问题，但是如果你消化很长时间后ips仍然很难脱落，那就要考虑你的iPS质量了，是不是传代过多多能性已经逐渐消失。脱落下来的feeder对贴壁的影响不大。

momocy

不是吧，老师不是教胶原酶IV消化要一个小时左右么，如果大的克隆很久都消化不下来，甚至吹打也不会掉下来的话，很可能就是分化了的，一般分化的克隆是后掉下来，所以在时间上就可以除去不好的克隆。消化之前还是洗一下好一点。

sarah19860420

回复 fananran2003 的帖子6 R+ Y$ H4 _! W2 N

' [1 e6 @1 _: o这个细胞是养了一个月以来第一次传代。之前是从别人的实验室要过来的细胞，所以应该不会是传代太多引起的吧。那会不会向楼上所说的分化了呢。不过看形态还是可以的。老师也没有说分化。我刚接触这个东西，还不太会看分化与否。

sarah19860420

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+ C9 N; `" l! A" R: K
我看protocol上面说胶原酶消化总和时间最好不要超过15min。大克隆我用枪吹很久都吹不下来。整个板子只有两个大克隆，结果都这样。

momocy

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% Q( d4 t* ?  n7 C: a你仔细观察一下大克隆，是否健康，还是有分化了，我是听说要消化1小时，你按照你的protocol来吧，毕竟不同的protocol也不一样。