逆转录病毒的包装

zhangtang

1.我有一个含目的基因的逆转录病毒质粒，想将该质粒包装成病毒后再感染细胞。由于之前从未做过病毒包装，我想请教一下群里的各位朋友，包装病毒的过程以及测病毒滴度难不难啊？是自己做好呢还是交给公司做？ & g+ W, ]: e. R7 }
2.如果这个逆转录病毒质粒不包装成病毒，可以直接拿来转染细胞嘛？

小兔子lp

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4 T/ y! \0 b; \. m* R0 f: M/ u2 h8 j) a/ k7 b
包装293T的话，细胞密度很重要，最好细胞融合率达90%以上再进行包装；另外，不同转染试剂的细胞毒性不同，比如罗氏fugene 的毒性要比天根lipofectamine 2000 小，注意试剂选择；再者，转染试剂的作用时间通常在8h内，因此，转染后6-8h 建议换成含10%FBS 高糖DMEM培养液，以减小转染试剂中毒性物质造成的细胞损伤；最后，PS双抗会降低某些转染试剂的转染效率，对于这些转染法而言，复苏培养293T 细胞时，培养液是不可以加双抗的。

小兔子lp

请教一下，我转的目的质粒（4因子）没有GFP标记，是否也可以通过DAPI染色观察荧光的方法来鉴别其转染效率呢？

liunianshui

回复 momocy 的帖子5 S' \  b0 b# \% E. `: K6 J
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这个还是很经典的啊0 _3 ^- I2 S0 q+ q7 D9 q! x

huangcong1988

回复 momocy 的帖子3 T* c. q- C& r9 b! j. d

6 y( {  P/ D9 q# p6 ~1 T( C; g你这个For retrovirus: 12ug of gene of interest, 6ug of Gag/pol, 1.5ug of VSVG是做过吗？还是就自己摸的条件呢？因为我之前看的好像是10:9:1，VSVG加的很少的，这个问题一直困扰我

细胞海洋

回复 99牵牵 的帖子  x  w! R; ?2 }3 d8 }& o9 L  f
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99牵牵

我的就是这个样子的，本身质粒没荧光，加一个GFP作对照！可是问题是我的包装细胞状态总是不好，包出来的病毒去感染293t荧光很不亮 而且很少 可以告诉我怎么个情况吗？谢谢啦!; M+ I, n% D& a& K1 A

momocy

回复 zhangtang 的帖子3 `3 }) ?2 M' Y) a  A& k
/ @1 g7 ?6 ^) u% f
你转染的时候，多转染一个GFP，也就是ＧＦＰ和质粒同时做，算出ＧＦＰ的滴度，然后你质粒的病毒和ＧＦP加的量一样多,这样不就行了么

zhangtang

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3 A. ~2 T; H% q- u2 W5 t2 G+ t
# ^. {  }8 m9 g: O# l" I2 S你好，你说增加一个GFP对照的话，是不是空白质粒flag也要包装啊？还GFP组就可以作为空白质粒对照组？

momocy

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你增加一个GFP的对照，通过GFP的来估算其他质粒