第一次养MDSCs

87hgl

这是我我第一次养MDSCs的步骤，当然以失败告终，准备明后天接着做，希望大家指出不同意见。
: b( X$ m0 r; {3 s6 O+ J将SD大鼠，4-6周左右，腹腔麻醉后取出小腿处肌肉，好像是腓肠肌，很少一部分，没有称重，大约1g左右，放入无菌盛有D-Hank‘s液的培养皿中，去除其他组织，再转入另一个培养皿，用组织剪剪碎，约有1mm^3，用D-Hank‘s液冲洗，转入试管中，D-Hank‘s液吹打冲洗3次后，800转/分  2min，去除上清液，加入Ⅰ型胶原酶（1%浓度）2ml，37℃水浴消化约40分钟，其中每10分钟取出进行吹打，最后一次进行滴片在显微镜下观察，看到许多条索状组织，未见细胞，然后加入适量D-Hank‘s液，吹打几次，2000转/分  10min，去除上清，加入Dispase Ⅱ（2.4U/ml）2.5ml，同上进行37℃水浴消化，约40min，滴片观察，可见细胞团块，单个细胞少见，上述条索状组织变少，变小，加入适量D-Hank‘s液，吹打几次，2000转/分  10min，去除上清，加入0.1%胰酶2ml，通上37℃消化40min，滴片观察可见单个细胞，圆形，细胞团块少见，加入胎牛血清终止消化，2000转/分  10min离心，加入D-Hank‘s液约有6ml，进行细胞计数，约有3×10^5个，1000转/分  8mim离心，去上清，加入生长培养基3ml（20%胎牛血清  10%马血清  1%双抗 DMEM）转入多聚赖氨酸包被的6孔板中进行差速贴壁培养，1h为PP1，转入下一个空2h为PP2，再转入下一个空18h为PP3，再过24h，观察细胞没有贴壁的，细胞也较少，最后实验室老师说细胞死了，就倒掉了~~~

jhu132llh

猜测可能是胰酶消化过度了1 V* S# o2 F1 d
胰酶消化40分钟太久了
6 B6 x# G, p0 w# x9 @& D估计很少有细胞能顶得住
5 o1 ~5 Y- e- z) F& x" L) h建议胰酶消化后计数时看一下细胞活性
# o( c: |" L( j+ o8 |- ]

87hgl

回复 jhu132llh 的帖子- z& G/ ~2 i9 R9 P5 p7 M7 }

( |3 D: {  ]( M; s- D! K# [; h3 c- V8 V那问一下胰酶一般消化多长时间？怎么检测细胞活性？

mhqh

回复 jhu132llh 的帖子! Y8 t+ Q5 O# ~0 @% h8 q1 c

) p7 }) {" C5 q" p' q你好！ 我收到了你加好友的请求，但是我没有权限加你好友。我甚至没有权限在你的空间里留言或者给你发送消息。我很伤心，不好意思啦。

dianying

回复 87hgl 的帖子$ T+ Q% m* c$ q% r9 N0 t

4 Q  r4 T9 k( f3 B/ Y1 ~) u. ]4 z最简单的看活没活可用计数板检测.
3 a+ b* P0 U/ X2 b1 @; P10ul trypan blue and 10ul cell culture, load 10ul in.
8 `$ M: C  s# p1 u, N  P/ v. u亮的就是活的，按方格数数再算量。

87hgl

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' h( _5 R/ t  r. S$ p! N* {7 L1 o7 _; p; z8 w9 M/ j+ R
谢谢

细胞海洋

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  s( ?9 U. l% n$ K% t- P- O' k* q8 o7 c: q3 W
积分达到50才有权限 抱歉了 多参与讨论吧

jhu132llh

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# `, L% ~4 a' S# k& ?  d" w) D2 K* {' F
0.125%的胰酶普通细胞消化2-5分钟，克隆一般消化5-10分钟' L1 M$ U) Y4 y+ N( K
检测细胞活性很简单呀
8 K& d2 P, V5 N1 s/ r; ?  A你细胞计数的时候不是要加4%的台盼蓝吗$ d. n, g* Z7 s
你观察细胞染色情况
& `& W* X# x, h/ v0 m3 y2 p9 k* O7 y排斥台盼蓝的细胞即为活细胞

mhqh

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9 ~- f5 ]% E$ [' F% y9 h# p/ \/ e( K% ^! z$ `
哦，好吧，我有好几个师兄在做细胞啊蛋白质啊金纳米粒子啊载药啊什么的，我以后向他们多学学...