第一次养MDSCs

87hgl

这是我我第一次养MDSCs的步骤，当然以失败告终，准备明后天接着做，希望大家指出不同意见。1 f2 O9 L, f7 M' [
将SD大鼠，4-6周左右，腹腔麻醉后取出小腿处肌肉，好像是腓肠肌，很少一部分，没有称重，大约1g左右，放入无菌盛有D-Hank‘s液的培养皿中，去除其他组织，再转入另一个培养皿，用组织剪剪碎，约有1mm^3，用D-Hank‘s液冲洗，转入试管中，D-Hank‘s液吹打冲洗3次后，800转/分  2min，去除上清液，加入Ⅰ型胶原酶（1%浓度）2ml，37℃水浴消化约40分钟，其中每10分钟取出进行吹打，最后一次进行滴片在显微镜下观察，看到许多条索状组织，未见细胞，然后加入适量D-Hank‘s液，吹打几次，2000转/分  10min，去除上清，加入Dispase Ⅱ（2.4U/ml）2.5ml，同上进行37℃水浴消化，约40min，滴片观察，可见细胞团块，单个细胞少见，上述条索状组织变少，变小，加入适量D-Hank‘s液，吹打几次，2000转/分  10min，去除上清，加入0.1%胰酶2ml，通上37℃消化40min，滴片观察可见单个细胞，圆形，细胞团块少见，加入胎牛血清终止消化，2000转/分  10min离心，加入D-Hank‘s液约有6ml，进行细胞计数，约有3×10^5个，1000转/分  8mim离心，去上清，加入生长培养基3ml（20%胎牛血清  10%马血清  1%双抗 DMEM）转入多聚赖氨酸包被的6孔板中进行差速贴壁培养，1h为PP1，转入下一个空2h为PP2，再转入下一个空18h为PP3，再过24h，观察细胞没有贴壁的，细胞也较少，最后实验室老师说细胞死了，就倒掉了~~~

jhu132llh

猜测可能是胰酶消化过度了) q# t) j5 n5 G
胰酶消化40分钟太久了, Q3 I% X( l' I
估计很少有细胞能顶得住
$ P9 h; j$ s) ~* U2 T建议胰酶消化后计数时看一下细胞活性
4 B9 A1 b! s  L# |; U

87hgl

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2 L9 J  S/ b( W4 h  @4 @8 }6 l* D: l' _
那问一下胰酶一般消化多长时间？怎么检测细胞活性？

mhqh

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: G4 z7 S# a# [' a' [1 y) X4 M$ E# a  D8 H4 `4 a3 s6 E% O, [
你好！ 我收到了你加好友的请求，但是我没有权限加你好友。我甚至没有权限在你的空间里留言或者给你发送消息。我很伤心，不好意思啦。

dianying

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' F5 A: i: d( b4 h2 ]# |  `/ X, Q9 c+ x, @+ j% k' A: w: R1 `
最简单的看活没活可用计数板检测.
6 E4 V6 L$ g3 b) q10ul trypan blue and 10ul cell culture, load 10ul in.
) p; D7 g/ a+ e' O' A亮的就是活的，按方格数数再算量。

87hgl

回复 dianying 的帖子0 D0 F# O& J, q" k. M1 C
& M( M, s  ~$ ]- M4 v! v! L
谢谢

细胞海洋

回复 mhqh 的帖子% d+ d4 H1 n5 c6 H1 @

" k! k: M' k* g" h积分达到50才有权限 抱歉了 多参与讨论吧

jhu132llh

回复 87hgl 的帖子1 n' I* F5 s& ]1 {. m* @  u, s9 _

( Q' ?( y, z: E( b0.125%的胰酶普通细胞消化2-5分钟，克隆一般消化5-10分钟
9 Q3 u4 U7 Y9 y0 C9 K$ B' ]$ a检测细胞活性很简单呀! G" s/ t; X# {( u' J, w" Y/ y" N
你细胞计数的时候不是要加4%的台盼蓝吗
4 l& Y4 Q+ [  c9 K你观察细胞染色情况3 r0 O( T. g% M7 a; K3 g; J
排斥台盼蓝的细胞即为活细胞

mhqh

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5 c! ?: b( I3 X( c4 C
* g* Q* c+ i2 h; k# i6 }* z哦，好吧，我有好几个师兄在做细胞啊蛋白质啊金纳米粒子啊载药啊什么的，我以后向他们多学学...