干细胞标记及追踪（专题讨论）

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干细胞培养诱导后植入体内，观察成骨效果，想做个标记，因为观察周期较长，大概三个月，经查阅文献发现，可行的办法有两个：4 A5 X1 V8 x: U
1，逆转录病毒将GFP基因导入干细胞，这种办法在导入基因时好像比较麻烦，但是检测好像比较简单。
8 T% `1 [* }' s, s2，将雄性干细胞植入雌性动物，追踪Y染色体，即SRY基因，但是看文献上说SRY追踪的FISH技术复杂，费用高，但是还没有看到具体的技术步骤，也不知道具体要多少费用。$ ^6 ?$ A+ K6 F8 f* U
      在丁香园上看到一篇关于干细胞追踪的帖子，2003年一直讨论到今年，很有见地，希望在干细胞之家的同志们也讨论下这个问题，或者请版主开辟一个关于干细胞标记及追踪的专题也好。谢谢！

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哪种方法更简单 费用更低 检测的结果更确切？

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Y染色体sry基因原位杂交操作步骤：
* W- ~9 X1 z: e& F* W一、PCR合成大鼠Y染色体特异性cDNA探针5 V3 }# z, ~, q! N  H; F5 L$ H4 l
1、  把107个细胞接种到400μl TNE缓冲液中（10mmol/L Tris、Ph7.9; 10mmol/L NaCl；10mmol/L ethylenediaminetetra-acetic acid），与400μl 20% 十二烷基磺酸钠和40μl 蛋白酶K（20mg/ml）混合。悬液涡旋混匀，37℃孵育12－15h。0 |4 j. O; a: o3 f
2、  DNA用苯酚提取，乙醇沉淀，TE溶解（1mmol/L Tris、ph7.9; 0.1 mmol/L of ethylenediaminetetra-acetic acid）。
" W6 J0 A! H$ y4 w3、引物序列设计如下：5' primer, 5'-AGATCTTGATTTTTAGTGTTC-3' and 3' primer, 5'-TGCAGCTCTACTCCAGTCTTG-3'。反应混合物包括1μg基因组DNA、引物各1μm、200μm三磷酸二核苷酸、1×PCR buffer，和2单位Taq聚合酶，终体积为100μl。进行30次扩增，每个循环包括94℃变性1min、50℃退火1min、72℃扩增2min。30次循环后，再在72℃附加扩增7min。PCR产物0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙锭染色检测片断大小，然后纯化准备杂交。% }/ g* o! ?  Q8 C% A( K. |% w0 s; Q" S
二、原位杂交- p$ J) q# I. H/ H( p
1、  切片去蜡，二甲苯水化，过梯度酒精，然后用蛋白酶K（100μg/ml）37℃消化15min。
; v( W  ?( E6 }0 M# B/ q' k- f2、  前面制备好的Y染色体cDNA探针用地高辛标记检测试剂盒做标记。
% B& G  L) K0 p* W8 d3、  杂交液在42℃过夜。用荧光抗体增强试剂盒（Boehringer Mannheim）可以在荧光显微镜下观察到地高辛标记的Y染色体，由异硫氰酸盐荧光素发绿色光。然后载玻片用10ng/ml亚丙基碘化物（Propidium Iodide，红色）复染，以使细胞核染色，加抗退色液和盖玻片。阴性对照不加探针或抗地高辛抗体，其它按相同操作。9 w$ k* I6 b$ ^* v

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综合各方报道，总结各种标记技术优缺点如下：5 W+ q7 V; q9 i$ n2 b1 v
GFP标记优缺点：
1 f! w" P6 B0 L" g& DGFP是从水母体内分离获得的一种发光蛋白，吸收蓝光，发绿光，且不需光发射辅因子。由于GFP在哺乳动物细胞稳定、荧光显微镜又容易检测，因此GFP已是常用的标记分子。
, o! [$ P  z! r, p% z" W优点：
6 T+ M' x+ X( g1 o$ y2 Y. X1，        GFP基因编码的GFP能自身催化形成发光结构，GFP产生荧光无须任何底物或辅助因子，在外光或者蓝光激发下能够发出绿色荧光，能够直接观察到。5 P' e; @) L4 }+ |
2，        成熟的GFP 蛋白是高度稳定的,在pH 为11 、65 ℃的条件下仍保持荧光,且数小时内不被蛋白酶降解。而且可耐受光漂白及福尔马林固定，所以能制成长期保存的标本。
0 F9 M1 u. U" j( ~% {( d3，        GFP相对分子质量小．这也是它作为报告基因的一大优点。. ?# v1 @6 o5 S* ?7 M- D  V& i
4，        GFP与目的基因融合后 对目的基因的结构功能没有影响，大量表达对细胞也无毒性作用，细胞仍可连续传代培养。5 A# Z( a, _* R$ Z  `1 j2 Y
5，        GFP作为荧光靶使用方便，可直接用于活体测定。GFP是目前唯一能在异源细胞内表达后自发产生荧光的蛋白，可进行活细胞实时定位观察，更能接近自然真实的状态。
3 c5 F& W, ~' s% T5 r6，        根据目前在各种生物中以各种来源启动子的GFP 表达情况来看, GFP 的表达本身是可以不受时空、组织及种属特异性等条件的限制。可以用作长期的标记。
2 D+ p8 d' |$ r( o; l7，        GFP 在接上各种细胞内定位序列(localization sequence) 后, 在活体中可直接观察各种亚细胞结构及其生活状态, 已有大量实验报道表明GFP 可定位到细胞核、线粒体、内织网、质膜及核膜孔等。. j& u# P3 S9 u  C1 N$ B$ g) K
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缺点：有的文章中提出外源的来自GFP转基因鼠的造血干细胞在受体内可能就不表达GFP了，是由于供受体间的细胞生存环境不同，所以能否用这种标记方法确切的研究干细胞特性还有争议。
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小结：GFP在多种苛性条件下都很稳定，分子量小，大量表达对细胞没有毒性等特点，使其在现代细胞生物学和分子生物学研究领域的应用具有广泛前景，被喻为十分有用的活分子探针，在基因标记、基因表达控制、转基因的动植物研究、蛋白在细胞中功能的定位及蛋白间相互作用等方面有十分广泛的用途。
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0 Y3 m, s/ R# ]优点：BrdU抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，经免疫组织化学染色可观察BrdU在细胞内的掺入情况，故BrdU标记和检测的准确性高、标记率高、方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞的理想指标。一般体内最长可维持2个月。
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缺点：细胞移植时间到达一定时间后，标记细胞如果发生凋亡或死亡其释放的BrdU则可掺入处于细胞循环S期的任何细胞．BrdU标记的细胞将不仅仅限制在移植细胞从而难以区分移植细胞和宿主细胞。

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) r1 \! n0 s/ A  r) s' [荧光染料标记：& A" @4 [; n4 T2 C
PKH26是一种红色荧光染料，能清晰地显现细胞的结构和内含物。标记效率起初达100%，随后逐渐降低，并且在一定时期后将检测不到标记的细胞。最长标记时间PKH-26为8周; s" |% a4 C; t9 w" Q

/ A( ?! f9 g6 _/ P9 ~' FDiI标记会细胞分裂增殖迅速衰减，体内只能观察到1-2个月。存在的问题就是细胞膜染料可能会与其它细胞潜在结合，造成假阳性。
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DAPI是一种显现活细胞或固定细胞DNA的荧光染料。没结合DNA的DAPI荧光很弱，而一旦和DNA结合，表现出很强的荧光。并且对细胞相对无毒，不改变细胞的超微结构。DAPI最大的优点就是标记技术简单，而标记效率很高（起初达100%），标记的细胞能清楚的观察到。缺点是细胞分裂将导致DAPI淬灭，以及收缩蛋白或其它蛋白染色所造成的强背景色等将引起标记强度降低。因此DAPI也仅适于短期定量分析。; ^) A; R5 L6 O" Q, I! m: a

1 Y( Z* p0 O; F  q% m& l; s6 k$ dBrdU标记法是近年来作为一种新的、简便、敏感、特异的检测方法，在遗传学、分子生物学等领域得到广泛应用。细胞增殖周期包括G1、S、G2和M4个时期，S期是DNA合成期．细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时，就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU在胞核的DNA中长期存留 有报道认为，标记BrdU的细胞只要不受到紫外线的照射，对细胞没有功能损害，该技术应用到跟踪检测移植细胞的存活、分化和功能状态方面。与同位素和荧光标记技术相比较，BrdU抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，经免疫组织化学染色可观察BrdU在细胞内的掺入情况，故BrdU标记和检测的准确性高、标记率高、方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞的理想指标。
, v# o9 K0 E8 s% W( e$ S3 ^BrdU标记细胞尚存在以下问题：细胞移植时间到达一定时间后，标记细胞如果发生凋亡或死亡其释放的BrdU则可掺入处于细胞循环S期的任何细胞．BrdU标记的细胞将不仅仅限制在移植细胞从而难以区分移植细胞和宿主细胞,造成假阳性。BrDU一般体内最长可维持2个月." Y$ O. |2 N+ N7 j

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磁性材料标记追踪：
# O- G0 ^, B# f5 e( L" W- w磁性标记用于追踪受标记的移植细胞在体内的运动信息，从而得知移植细胞的未来命运。通过MRI技术对干细胞进行可视化和追踪，需要将干细胞进行磁性标记以便它们能与其它组织有所区别。(superparamagnetic iron oxide particles）SPIO相当于MRI造影剂，方便追踪。但是SPIO可被降解、代谢， 一般经过5-8个细胞分裂周期后就会消失。

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Y染色体标记细胞追踪移植细胞技术 选用雄性供体和雌性宿主，利用Y染色体作为标志物，最大的优点就是标记技术简单，而标记效率很高，利用FISH技术进行追踪标记的细胞能清楚的观察到。适合长期体内试验定量分析，但是FISH检测技术比较复杂

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另一种长期标记方法：人MSC回植动物体内，检测HLA，与Y染色体标记相似吧

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" l6 ?- g9 S" Q The BrdU labeling signal quickly decreased over time. Thus, BrdU should only be used to temporarily label dividing cells. " l7 ?+ J& v' i7 s& i; \
DiI and FISH labeling may be used to steadily trace cells during invivo experiments.

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SPIO可被降解、代谢， 一般经过5-8个细胞分裂周期后就会消失。