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综合各方报道,总结各种标记技术优缺点如下:% D6 v. |) H' i: S0 Q! p
GFP标记优缺点:8 M' I O0 U% \9 o" x; Q' a* k) S* Z
GFP是从水母体内分离获得的一种发光蛋白,吸收蓝光,发绿光,且不需光发射辅因子。由于GFP在哺乳动物细胞稳定、荧光显微镜又容易检测,因此GFP已是常用的标记分子。+ |3 x# X- O* H% c' n; i
优点:
4 Z! ?4 P( ]0 w1, GFP基因编码的GFP能自身催化形成发光结构,GFP产生荧光无须任何底物或辅助因子,在外光或者蓝光激发下能够发出绿色荧光,能够直接观察到。/ k' ~' i! s( t4 w9 F. f
2, 成熟的GFP 蛋白是高度稳定的,在pH 为11 、65 ℃的条件下仍保持荧光,且数小时内不被蛋白酶降解。而且可耐受光漂白及福尔马林固定,所以能制成长期保存的标本。
4 _& S- q B. N3, GFP相对分子质量小.这也是它作为报告基因的一大优点。
3 `0 H, ?5 S0 \* P9 u" J4, GFP与目的基因融合后 对目的基因的结构功能没有影响,大量表达对细胞也无毒性作用,细胞仍可连续传代培养。3 ]0 w6 D8 x8 U- z p
5, GFP作为荧光靶使用方便,可直接用于活体测定。GFP是目前唯一能在异源细胞内表达后自发产生荧光的蛋白,可进行活细胞实时定位观察,更能接近自然真实的状态。
) n4 {! P3 i! [) C6, 根据目前在各种生物中以各种来源启动子的GFP 表达情况来看, GFP 的表达本身是可以不受时空、组织及种属特异性等条件的限制。可以用作长期的标记。
0 h& c' f# f; U3 T; d7, GFP 在接上各种细胞内定位序列(localization sequence) 后, 在活体中可直接观察各种亚细胞结构及其生活状态, 已有大量实验报道表明GFP 可定位到细胞核、线粒体、内织网、质膜及核膜孔等。- M) h' N# q2 f6 S
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缺点:有的文章中提出外源的来自GFP转基因鼠的造血干细胞在受体内可能就不表达GFP了,是由于供受体间的细胞生存环境不同,所以能否用这种标记方法确切的研究干细胞特性还有争议。
* P: z' w" z2 Y; T) L2 c( S9 L0 l1 b; Z4 l' w' o9 _' q. q. x
小结:GFP在多种苛性条件下都很稳定,分子量小,大量表达对细胞没有毒性等特点,使其在现代细胞生物学和分子生物学研究领域的应用具有广泛前景,被喻为十分有用的活分子探针,在基因标记、基因表达控制、转基因的动植物研究、蛋白在细胞中功能的定位及蛋白间相互作用等方面有十分广泛的用途。) C0 V& m5 @' e. v p' t/ b
9 `0 ?# U9 l8 t t+ B/ g" v9 V优点:BrdU抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应,经免疫组织化学染色可观察BrdU在细胞内的掺入情况,故BrdU标记和检测的准确性高、标记率高、方法简便、迅速、安全,是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞的理想指标。一般体内最长可维持2个月。9 d6 c( \* s t) h
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缺点:细胞移植时间到达一定时间后,标记细胞如果发生凋亡或死亡其释放的BrdU则可掺入处于细胞循环S期的任何细胞.BrdU标记的细胞将不仅仅限制在移植细胞从而难以区分移植细胞和宿主细胞。 |
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