请帮忙分析下RNA电泳结果

cneagle66

下图中间三条带的RNA还可以，虽然有降解（一般28S应该更亮），但是还可以用，其他的标本，降解严重，如果对实验严格要求的话，这样的RNA最好不用。- B9 r$ h' |+ V3 u) S( C
DNA污染：对于一般的RT-PCR来讲，设计引物的时候，可以横跨两个外显子，避免了DNA的干扰。对于荧光定量RT-PCR，我觉得也可以这样，比如我曾经用的SYBR green，它的扩增片段长度可以在200bp左右，完全可以找出横跨外显子的引物来。至于用探针的荧光定量PCR，我没有做过，没有深究过它的原理，因为扩增片段只有几十个碱基，可能设计跨外显子的引物比较困难，但也可以一试，不知道行不行。

cneagle66

jiojoo 发表于 2011-12-5 17:14
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我在做RT-PCR之前都会用DNaseI消化DNA的，这样DNA应该可以去除干净了吧？

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DNase消化是很常用的办法，应该是很好的去除DNA污染的办法，严格的实验都要求将DNA去除。; M6 E' ~2 S2 A* M: D1 |" E' }  a2 D
对于哺乳动物RT反应，用Oligo dT或者随机引物都可以。我前面说的引物设计问题，是指在PCR那一步，普通的RT-PCR可以通过设计横跨两个以上的外显子，来避免DNA污染所造成的扩增，因为DNA扩增出来的片段很大，或者因为内含子很长，从DNA扩增效率很低或不能扩增。但是对于荧光定量的RT-PCR，我不知道是不是也可以这样。至少我用sybr green的时候我是这样设计的，因为它不用探针，而且PCR产物较长，在一个大的范围内比较好挑选PCR引物对。但是对于用荧光探针的定量PCR，我没有经验。

cneagle66

加了TRizol的裂解液，按照说明书要求，是要放进-80度冰箱保存的，它的目的是要长期存放，比如一个月。不过，我曾经因为操作失误，放进-20度冰箱中一周，后来又提取RNA，效果没有什么不同。所以短时间-20度存放，应该还可以。