应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞

zarecol

抛砖引玉，酶解法和机械法均可获得比较理想的原代细胞（各大文献中方法都很详细，也很到位请各位查阅，在此不做解释），但怎样保持细胞状态常常是我们在实验室培养工作中的难题，稍有不慎细胞就会出现各种问题，有时让还真让我们头痛。2 `5 b; i, e/ }! b9 h+ P- ^
常常看到很多回帖的仁兄发表细胞养到10代20代仍然保持良好的形态，心中十分羡慕，所以发表本帖也是有感而生。- I: I& _5 {: h( l. z5 }( u5 u1 }& U
首先献上我的经验之谈，希望我们能共同探讨，相互学习。脐带间充质干细胞培养，分离方法有酶解法和机械法，两者获得的细胞状态都差不多，机械法的细胞较好，对细胞损伤小，但缺点是时间长几天，不过个人感觉利大于弊。所以我推荐采用机械法分离获得原代细胞。这个步骤的关键我认为是速度，为什么这么说呢？原因在于所用脐带的离体时间和开始分离到培养液接触组织块的时间决定了原代密度达到80%融合所需要的时间。培养液的选取也很重要，DMEM和DMEM/F12的培养液作为基础培养液都是不错的选择，血清建议采用进口血清浓度10%。传代时采用0.25%胰酶37摄氏度进行消化，终止消化采用等量血清。4 S# T8 V- X1 v! B1 O# N
以上是我培养细胞时采用的方法，但并不能每次都获得形态良好的细胞，这是我的问题所在。
$ K. s9 r$ [: E# Y: a( d细胞形态保持3代左右的长梭形，之后细胞开始向扁平状发展，而且培养液变黄的很快。希望大家能给予我这方面的帮助。谢谢。
; l% L( A% K& v6 {% e# l

bings214

回复 xbqian 的帖子5 n. T6 C1 g0 f. u0 f6 |  `" g
' E" {- p1 H" j8 a
请问你们所采用的三种酶混合的比例是多少呢?

湖南干细胞

回复 xbqian 的帖子' w! [6 O+ O$ S% Z  F5 ]

9 B3 k. V; y! ]  H: V# V请教，这几种没的比例和浓度是多少？6 m1 K: N6 G$ C1 F) |6 ^: l. d

wjsatx317

消化胰酶浓度还是用0.125%的好，以前用过0.25的，对细胞损伤较大，影响细胞后期的状态。, k1 ^* R" U9 r1 y4 E: l% q
至于培养基很快变黄建议你还是往培养液里面多加一倍的碳酸氢钠，这样调节能力强一些。要不你就让厂家检测下CO2的浓度是否有准确，是否需要校准。
( p% Q( I- P0 q* y7 w   取细胞还是机械法和酶解法结合比较好，反正胰酶不值钱。呵呵

cactus006

回复 sdwzg119 的帖子
5 ?' a) t- S$ f9 `) u0 g/ |% V' d2 s! e0 C0 ?  ]+ K
您好，您能分享一下您的培养基条件么，我养的脐带间充干细胞，传到第二代细胞就开始变得扁平，粗大，没有立体感，感觉是老化了，不知是哪儿的问题，我现在的培养条件是L-dmem+10%FBS(HYCLONE南美血源）+2ng/ml bFGF，请您帮忙分析一下原因，非常感谢！

cactus006

回复 ditiger 的帖子
* Q/ `) o/ d7 J- J7 ~6 g
1 [7 R/ r6 b: k# y* k! P您好，我也是用贴壁法养脐带间充干，但是细胞一般到三代就开始变的扁平，粗大，没有立体感，感觉像是老化了，不知道问题在哪儿呢，是不是与用的血清有关系呢，向您请教一下？

lazyworm

我们虽然培养过程中会出现一些小的问题，但是总的来说组织块贴壁法是比较稳定的，我们的消化浓度是0.125%，消化时间因人员熟练程度而不同，有时候有人都超过了7分钟，但是细胞好像还是挺好的。当然这可能会对后续的传代有影响。0.05%的浓度还这么快，有机会试一下。

zarecol

回复 sdwzg119 的帖子
! |/ y- s  d) R, k6 g0 f
  Y; r6 L+ k( z# D谢谢！

sdwzg119

回复 zarecol 的帖子* ]9 Y+ e7 [% ?( W0 G2 e0 P

9 e8 G: U1 y4 l针对消化来说：我个人感觉一直在显微镜下观察为好，一直看到细胞回缩明显，轻轻拍拍细胞就会悬起来，但是这也是经验之说，细胞之间是有差异的，总之我现在的做法是尽量短，即使是放入培养箱37℃消化也是1分钟拿出来看一眼，确保没有消化过头。我用0.05%的胰酶，一般多数拿到显微镜下消化就差不多了，在有就是放入培养箱1分钟，最多消化3分钟。
3 W. R4 [; r' T+ M+ ~/ H; B" v+ q传代据说80%最好，可是这谁能控制的住细胞的长势呢！！！经常今天看着不到80%，明天就长过了！头疼！一直头疼！
) S* U: i: J8 _8 X6 x# l

zarecol

回复 sdwzg119 的帖子
/ d# r1 [) d7 c$ W. Z- T- V9 \9 b7 _4 _* [( r+ R  L+ T% F
消化终止点怎样确定呢？细胞长到多少密度的时候传代最好呢？