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细胞复苏率很低是怎么回事啊?   [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2012-2-11 11:35 |只看该作者 |正序浏览 |打印
年前冻存了一批C3H10T1/2细胞,过完年回来后复苏率还不到30%,怎么回事啊,愁死啦。冻存液用的是10%胎牛血清+10%DMSO+完全培养基,-4°C二十分钟,-20°C三十分钟,-70°C过夜,液氮保存。
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发表于 2012-5-3 20:28 |只看该作者
请问冻存的时候将细胞直接放入-80冰箱过夜,第二天再转入液氮长期保存这样是否可以?
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发表于 2012-4-28 14:00 |只看该作者
第一点:冻存液要和原来细胞培养液基本一致9 r7 @2 Q5 L3 h6 w& N* ?; \7 W3 X, C9 C. ^
第二点:买一个程序冻存盒(节省时间节省操作,效果很好)
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发表于 2012-4-24 09:24 |只看该作者
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我们都是用90%FBS+10%DMSO,冻存液要事先预冷,冻存时在冰上操作,(冻存管,冻存液都要在冰上),然后放在泡沫盒里,直接放到-80度过夜,再转入到液氮。一般复苏的存活率都能达到88%以上。
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发表于 2012-4-12 13:14 |只看该作者
本帖最后由 flyingatom 于 2012-4-12 13:14 编辑
4 Z$ Q2 H" Q  }' w( Q9 F8 D
/ S7 P5 Q7 {# g4 G1、冻存液里多加点血清有帮助,但不至于能从30%提高到90%# Y2 T5 m0 p% }$ @- U
2、在各个温度间变换(特别是从-80到液氮)要快,如果从-80放到液氮里的时间超过3分钟,虽然细胞仍处在冻着的状态,但温度已经超过了-50度,会对细胞造成很大的损伤。(见 culture of animal cell-a manual of basic technique. 5th ed1 g* A7 i2 }* \" x, M) M$ V
3、新年期间液氮补充及时么?液氮罐里有没有出现温度变化的情况?同一个罐子里同一层的其他细胞咋样?) o& ?( u# T2 V
排除了上面的问题,其他同学关于慢冻速溶的描述已经很详细了,参考下,那些步骤应该不存在大问题。
2 Z- S$ p" V/ u& p1 i另外,细胞是否用棉花或泡沫包围的比较妥当?这一步骤简便起见可以直接买个nelgen的程序降温盒。  U& z: n% o# ]
希望能有帮助。
% i# k) q3 ?) d' {( Y:)
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发表于 2012-4-10 08:55 |只看该作者
回复 冰枫de梦 的帖子
" [* Z; }4 K& ^9 }$ @2 B! l. M
1 [9 p9 u, S1 Y1 J) }你说的冻存液的配方我也用过,没有问题。胎牛血清和DMSO为9:1的配方我也用过,效果差别不大。我考虑与你冻存时细胞时的状态有关,当时的细胞状态不特别好,可能被忽略了。
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金话筒 优秀会员

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发表于 2012-4-10 08:31 |只看该作者
你血清的浓度太低了,我们一般用的为50%的浓度,你的太低了,会使细胞膜破裂导致细胞死亡
3 e# _: j+ c% r' ^. v/ o
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发表于 2012-4-10 06:42 |只看该作者
本帖最后由 hsution 于 2012-4-10 06:43 编辑 ; g1 A/ k* D$ _

' v) n4 B# s+ a! h" g# a" q7 V缓冻速融是原则
. ?0 ^" V9 {( I% ]) S1). 90% FBS+ 10%DMSO
6 b/ I! Q! e' j4 t, G5 c* C! F2)From Stemgent公司protocol.
- Q0 M# s; O$ L/ T2X miPSC Cryopreservation Medium & |' A) o0 X- w; K  f4 n
60 ml  DMEM  2 a# B  ?5 |( i! p9 Z. e
20 ml  FBS (Hyclone) or ES-Qualified,  defined FBS  # k  \! r& m, V- i
20 ml  DMSO 8 g. v; [' i' Q+ T5 u2 O* H
Filter-sterilize medium using a 0.22 μm pore size, low protein-binding filter." v: H' C4 U# U. a5 D
Make 2X miPSC Cryopreservation Medium fresh before use and keep on ice at all times.
1 F+ G4 B( J+ k5 F6 g- R
: H6 X  r' R" i  s- yNote:  Work quickly once the DMSO-containing 2X miPSC Cryopreservation Medium is added to the cells
; x: [; x$ j% ~" K3 ]% v' r, b8 {" u+ c3 m5 S# W( @
3).# C, Y9 @! u4 z7 {- U& O
Stemcell 公司CryoStor CS10冻存液 ready to use/ ^. p( e. N" r, e3 l4 Y
/ |. Z$ W5 \6 B, f- K
以上三种冻存液我都用过,感觉差别不大,一定要排个one two three,
9 {# A7 B& i4 K3 m! }9 h9 t对我个人而言 3)>1)>2)- |# q+ }+ @6 {  v: C
根据经济情况自行考虑选谁 哈,毕竟现成的公司货方便好用 但它贵.8 |  h- V" D; j1 S% Q

5 U" P9 u* {+ s( D* ]  N+ j复苏我是按stemgent的miPSC复苏protocol操作, 另外个人习惯取冻存的细胞之前,准备好水浴 超净台里的一切 包括管子(Ready to use的状态 节省时间),自带冰盒(有时干冰有时用普通冰),如果去取细胞的路途较长,则自带一烧杯37-8度的水,边走边融,<5min, 2-3min最好,融到管内还有一点点小冰坨即可后续操作(速融):2 |7 F1 U, k) g& Q# m$ K5 Z2 t2 w  K
1. Remove the vial of cells from the liquid nitrogen storage tank or -80.  
$ W3 f& Q; W. W- r) [) o2. Roll the vial between gloved hands for 3 to 5 seconds to remove the frost.  & }0 m- R" h* ^1 G6 j
3. Immerse the vial into a 37°C water bath.
' p1 i/ O: E1 _. ]5 aNote: Do not submerge the cap of the vial in the water bath to prevent possible contamination.  8 e# z3 o3 f' f& F
4. When only a small ice crystal remains, remove the vial from the water bath and spray with ethanol to sterilize.  4 Y8 Q. {+ b0 m# [* S$ U1 M! E2 l& L- A
5. In a sterile biological safety cabinet, transfer the contents of the vial directly to the bottom of a 15 ml conical tube.  ) R% j; N( g! P+ }
6. Add 5 ml of pre-warmed Culture Medium slowly while gently mixing the contents of the tube. Adding medium slowly will reduce osmotic shock to the cells. * k/ o+ l) r( P& y( {
7. Centrifuge the cells at 200 x g for 5 minutes at room temperature.$ m5 N" Q/ `/ N- q, }
8. Bring the pelleted cells back to the biological safety cabinet.   U0 S) f' I( ?8 Y/ r/ x
9. Carefully aspirate the supernatant from the cell pellet.
0 l- T9 `. I5 {  ~/ J2 ~0 N5 Q2 ?....3 B" a% j) n  A) h; I! k! d# w
希望能有所帮助,尝试一下 必有一款适合您
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发表于 2012-3-29 17:11 |只看该作者
冷冻细胞时,血清的浓度的高低对细胞的生长是有影响的,建议楼主将血清浓度提高到50%,加入10%DMSO,加入40%细胞悬液。同时在冷冻时在4度的时间大约在30分钟,不要太久。可从4度直接放入-80度,在-80度的时间 是17小时以上,然后投入液氮。如果经过-20度,最好不要超过2小时在-20的时间,细胞在-20度的作用是将细胞悬液冻住,时间太久会产生冰晶,从而将细胞冻死。楼主可以看看《细胞培养基本操作指南》这本书。
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发表于 2012-3-28 13:56 |只看该作者
回复 YYQ6301 的帖子4 ^, w) v8 U' J

& o" s8 H1 i6 w  h1 M8 W不会的,以前也是用90%FBS冻存的,复苏很正常,就是考虑到90%FBS冻存细胞成本很高
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