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细胞复苏率很低是怎么回事啊?   [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2012-2-11 11:35 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
年前冻存了一批C3H10T1/2细胞,过完年回来后复苏率还不到30%,怎么回事啊,愁死啦。冻存液用的是10%胎牛血清+10%DMSO+完全培养基,-4°C二十分钟,-20°C三十分钟,-70°C过夜,液氮保存。
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金话筒 优秀会员

沙发
发表于 2012-2-11 12:12 |只看该作者
要用纯的FBS和DMSO9:1保存,你家的培养基里面有很多水,细胞当然冻裂掉啦!先-80冻一下然后放进液氮里面。你那个方法哪里看来的?
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藤椅
发表于 2012-2-11 13:00 |只看该作者
细胞冷冻复苏的环节和条件比较多,而且不同的细胞冷冻过程和条件也不一样。建议你先查资料,再实验摸索。没有个七八次实验想活率达到90%以上很难。常规冷冻复苏条件掌握好,细胞活率不亚于程序降温仪冷冻。
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板凳
发表于 2012-2-11 14:40 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
我们这里冻存细胞是前一天换液,冻存液采用的90%的小牛血清+10DMSO,4℃,20min;-20℃,2h;-80℃保存。如果要放液氮的话,那就在-80摄氏度过夜,再放入液氮中。
7 \8 |! @; J0 g4 Y- s* W复苏的过程也同样很重要,要保证尽可能快的融化。我们都是放入37℃水浴锅,并一直保持摇动,直到完全溶解。
( G3 k; J' s" z! f1 z9 v' z/ p) ]1 p/ \培养过程中,可以离心收集细胞,用10%胎牛血清的完全培养基重悬后加入细胞瓶中培养;也可以用融化的冻存液加入到10%血清的培养液中培养,不过由于DMSo对细胞有毒害作用,所以必须要在24小时后换液。
9 p  l4 f6 {" n. g$ L在胰酶消化细胞和离心重悬细胞的过程中,胰酶和吹打过程的剪切力对细胞伤害很大,所以最好不要过度消化和过度吹打!
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报纸
发表于 2012-2-12 10:22 |只看该作者
我一般都是用梯度降温仪;复苏时用37度温浴,但是不能时间长,因为温度高时DMSO对细胞的损伤很大,最好解冻到还有一点点冰晶时就停止,效果不错的。
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金话筒 优秀会员

地板
发表于 2012-2-12 10:32 |只看该作者
对于楼主的冻存细胞和复苏细胞的方法个人觉得需要改进,10%FBS+10%DMSO+培养液,FBS的浓度低了,改成20%更好一些,90%的FBS我认为太浪费了没有这个必要,除非是很精贵和要求很高的细胞可以使用。在进行降温的过程中,4℃放置的时间短了,应该是2小时,之后-20℃2小时,-86℃过夜后放入液氮,如果有-40℃冰箱的话可以加入这一步(2小时)。因为从你的降温时间来看,时间短了。按冻存要求是1分钟下降1度来进行的。复苏的话就是水的温度一定要在37-38度,反复的摇动直至溶解。
0 C! m) w# x, Z2 X+ r* w2 o6 o1 q& Y以上只供参考,如有不对还望指出!
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发表于 2012-2-12 13:46 |只看该作者
回复 冰枫de梦 的帖子
* I' R- p( `: j7 M! q; p, q9 o7 F
* s+ n  _5 p, D* p# K( W3 T你冻细胞的方法和我差不多,唯一不同的是,在4度和-20度中放置的时间不同,我放置的时间是,分别为3个小时,之后在放入-80度中过夜,之后再移入液氮,复苏时的活力就非常好。
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发表于 2012-2-12 16:50 |只看该作者
回复 学无止境 的帖子% W/ m1 Z8 a" d. E! t+ B: f! E; _7 L/ ^
( b2 ?/ L9 i$ R, K7 j, J) {
-20度放置时间好像不能太长吧,时间长的话好像细胞内容易形成结晶,看资料一般都两个小时以内。
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发表于 2012-2-12 19:38 |只看该作者
应该是90%的FBS, -20℃应该是2小时,另外也可能与你复苏的手法和快慢有关 ,一般采用的是缓慢冻存、快速复苏
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发表于 2012-2-14 13:59 |只看该作者
你的FBS量太少啦。我们是4度10分钟,-20度2小时,-80度过夜,液氮长期保存。
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