胶质瘤肿瘤干细胞

xiaqs2002

大家有做原代胶质瘤干细胞分离吗？  m1 O8 X( J8 s; `. N

) {# j, b. g3 b一起交流交流经验吧！

细胞海洋

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- H5 R$ ~7 }' x9 ]( X0 c/ T抱砖引玉 你先说说吧

xiaqs2002

大家好！8 M: ]* O# n7 N) f: n
我最近尝试从ren胶质瘤样品中分离胶质瘤干细胞，把组织减成肉糜后，用胰酶消化了30-60min，吹打混匀，过200目筛子，接种在DMEM/F12 B27,EGF bEGF(各20ng)培养基中培养，到现在已经有2周时间了，中间发现了不少贴壁细胞，一直没有明显的肿瘤球长出，只有些疑似的球状物（后面我补照片），感觉像细胞碎片团堆积或者是消化不完全的组织块，而且疑似球状物大小也没明显变化，感觉不像。 有几点疑问，和大家交流甲流。
& c% h3 o' i! o1.消化时候，用胰酶是否太强烈了，我看到有的胶原酶或dispase等9 ^; o6 z4 D3 ^' S7 t, O% s: J# F
2.过筛我是参照文献用的200目，我感觉用400目应该会更好些，因为可以去掉未消化的组织块。
  p% g7 O( x) ?* s8 K4 E3.如果长成肿瘤球，一般多长时间可以长出，多长时间没有肿瘤球长出的，就可以放弃实验？4 j' h! |3 ]% H
4.贴壁的细胞一般是什么细胞，有保留的价值吗？) W8 `# O" N$ p* T! A6 I
希望和大家交流交流！% e+ g$ j6 v$ |1 L( y$ l6 D

jojomayer

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我感觉胰酶太强烈了，而且你消化30、60min？这时间是否过长啊？
( x! U" s$ y+ z# B3 a  x我准备用Accutase
8 \7 Z/ j! l- @7 `% u我也是刚刚开始做人胶质瘤干细胞样细胞的原代培养，还没有成功，我想那些贴壁的细胞是不是成纤维细胞？或者已经分化的肿瘤细胞？我现在也是一头雾水，咱们多交流吧。% L% k* f3 b; w9 ^9 R
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我看的文献有的说长出细胞球约3-4天，8天的时候就可以传代了，感觉太乐观了……; d! M- ^/ b# r( P6 M

9 W& U, @' L8 t8 S* {过筛的，我还没试过，感觉最好能不过筛，尽量多保留一点细胞，稍微多吹打一下+ h, h! w; L2 _2 i' }0 g. Q( U8 t
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我想问问你看过的文献中有没有使用冻存胶质瘤标本解冻后再像新鲜组织一样进行一系列操作的？冻存的胶质瘤细胞呢？

xiaqs2002

由于最近比较忙，没有上论坛！* ~, x8 @. q/ g! i
非常感谢你的建议！
! i$ P; s8 P0 N: u% s9 A我还在继续分离胶质瘤干洗吧，前一阵总共分离了10例胶质瘤瘤样本，有三例长出了肿瘤球，目前正在鉴定中，结果还可以。
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我的经验是胰酶消化还是可以的（30min以内），但可能会损伤偏大，我后面准备全部换成罗氏公司胶原酶和dispase酶消化。
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( @- v- Z- W! q4 r2 x4 ~! t我观察到的是长出球也就3-4天，如果超过一周没有球长出，基本就长不出来了。5 v+ T: [* e9 i# i1 J& o
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我后续的实验过筛都是用BD 40uM的筛子，感觉还可以。
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* m  ^* H' i8 }$ W! t8 U9 f另外一个经验是用的组织不要太多，尽量剔除坏死组织和血凝块。
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我用的都是新鲜组织，冰的hanks液保存，术后两小时以内分离，我感觉冻存的组织应该不行，没见过文献用冻存的组织分离过。) R% a0 D6 C! n5 M- {1 ^2 }

2 r% m& n! `1 f! ~! @欢迎多交流！7 V; M! I' F7 T; K& g

wyeric

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# M4 ~; J! R" l$ v( |& F# |楼主鉴定用什么方法