PCR 检测支原体

lingminliang

哪位做过PCR检测支原体，请赐教具体步骤  ，谢谢

初学者

楼上回答的很详细啊

牙牙丫丫123

PCR检测支原体方法如下：/ A) D' }( d# R# e+ b% ^' ?8 B
1、吸取待检细胞的培养液100ul，转移入无菌的1.5ml 离心管中。请注意：待检细胞必须换液24小时以上，否则会有假阴性结果。
/ t0 y" J" h" p5 H7 C  z. ^2、将盛有100ul待检培养液的1.5ml 离心管用金属浴或空气浴在95℃加热5min。请注意：加热过程中，要保持离心管的盖子是盖紧的。（因为在加热时，盖子会自己崩开，可以在离心管上放置书本之类的物品压住盖子）7 g& x7 e7 W' l( l- p- ~$ k
3、高速离心，13200rpm，1min。+ j: [2 U  |1 E* K* Q
4、配制PCR反应体系：
! f: F# K) N# n1）待检样品数量+1个阳性对照+1个阴性对照=总的样品数量。( n- Z% R3 _8 L+ x( y) ~
2）阳性对照是以往确定被支原体污染的样品，阴性对照是灭菌超纯水。
' p. G2 m2 I; `% n- d3）PCR反应体系：1 c8 b; C2 ~) q9 x# T& B
H2O（灭菌超纯水） 13 ul; W( v" V' {# i4 T4 [+ |  A" [
Buffer 10×（必须含Mg2+） 2 ul
# ]3 \  I& h  I7 q1 m6 n$ @5 ~' k6 QdNTP 0.8 ul
: A( D% h1 @; l$ l: \5 i% D$ XPrimer(+) (10uM) 0.5 ul
/ b/ O/ {+ @& lPrimer(-)(10uM) 0.5 ul
; |8 \( W; ?* _6 M9 R; s0 gPolymerase 0.2 ul0 g. O4 H; _7 J' N/ T# m. J3 y" I
Sample 3 ul
; U0 z1 w4 Z, [) K4) PCR反应程序：* _8 ^& @/ F9 c8 h% p
94℃ 2min+ r' [4 D7 S$ Y/ [  Z3 D
94℃ 30sec
: q3 q" v6 z' ^3 u5 E55℃ 30sec
+ ?- J8 R7 P# k) d$ _/ ]' M  ^72℃ 20sec$ D8 |2 R( _( A+ d
GOTO step 2 , 36 times
4 w: y8 e8 M3 I, r' y1 ]72℃ 7min$ `# G2 n- g; N. f# h
5、配制2%的琼脂糖胶，上样量5-10ul。
  m% n5 z% w$ G4 S2 v6、20-30min后观察结果，阳性条带在200-300bp。& g7 i+ j% O8 U
引物序列：
  U) ]* \5 D7 n0 E9 VPrimer(+)：5’GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT3’
2 s$ ^( J4 A  H1 z/ nPrimer(-)：5’TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC3’

huahua2008

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8 _; c( J0 ^  E3 H: ]有可检测支原体的试剂盒，上面的步骤很详细，祝你好运！