PCR 检测支原体

lingminliang

哪位做过PCR检测支原体，请赐教具体步骤  ，谢谢

huahua2008

回复 lingminliang 的帖子, |* D8 `/ b1 B. Y2 R/ b
6 m$ f; X/ S0 _, s- R# n8 f: ~
有可检测支原体的试剂盒，上面的步骤很详细，祝你好运！

牙牙丫丫123

PCR检测支原体方法如下：
, S# A" n' n8 h8 S# }( K6 }1、吸取待检细胞的培养液100ul，转移入无菌的1.5ml 离心管中。请注意：待检细胞必须换液24小时以上，否则会有假阴性结果。/ ]! _( y! D+ h% i( O, E, @
2、将盛有100ul待检培养液的1.5ml 离心管用金属浴或空气浴在95℃加热5min。请注意：加热过程中，要保持离心管的盖子是盖紧的。（因为在加热时，盖子会自己崩开，可以在离心管上放置书本之类的物品压住盖子）4 {# F9 R' h/ A
3、高速离心，13200rpm，1min。" k* u8 i6 F" E8 o/ ~/ b
4、配制PCR反应体系：
4 x# {4 M4 O/ ?( q- R1）待检样品数量+1个阳性对照+1个阴性对照=总的样品数量。2 z( ?$ l# p! N/ K# J- L/ L
2）阳性对照是以往确定被支原体污染的样品，阴性对照是灭菌超纯水。
) N' w! ?: I% j4 d5 Y+ t3）PCR反应体系：
/ p, }, I& T; T' K) y" j9 `H2O（灭菌超纯水） 13 ul* [, V: T, X1 q
Buffer 10×（必须含Mg2+） 2 ul
& Y" Q7 `3 T' ZdNTP 0.8 ul
! {, _- b& v4 O2 u  _% G" g9 a1 q* OPrimer(+) (10uM) 0.5 ul8 G! l- v8 A8 F6 A1 Y. x5 [
Primer(-)(10uM) 0.5 ul
  o  c/ H  ?1 J& F8 k5 N  C: H0 NPolymerase 0.2 ul0 A5 h+ a, I/ @4 t) h7 j2 T
Sample 3 ul
$ g# Q( E3 b) X  f' @4) PCR反应程序：  n+ y0 F( L9 ^* k0 A0 k
94℃ 2min
$ I9 O3 _4 u" k8 |5 K* q2 i) {3 ~1 u0 m94℃ 30sec. F. z; o4 |+ M8 @
55℃ 30sec
# j) i4 J' ~0 f72℃ 20sec4 ~* q6 W3 M- g6 N3 V( F% V* `" @
GOTO step 2 , 36 times! V# d. M. J/ u/ Q* a* D2 O- f
72℃ 7min6 V  f; q: y0 }' u
5、配制2%的琼脂糖胶，上样量5-10ul。9 Z9 x4 t* F# i- p3 p
6、20-30min后观察结果，阳性条带在200-300bp。- z# l1 ?3 D6 J* [. F
引物序列：
# y' |& t0 b& M5 N3 cPrimer(+)：5’GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT3’9 t+ ^, f8 I7 {8 w0 H" s; S
Primer(-)：5’TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC3’

初学者

楼上回答的很详细啊