求助：间充质干细胞脂肪诱导分化？

stefan

又做骨髓间充质干细胞向脂肪方向诱导分化，前做完Oil-o-red染色，但是染完色镜下看不见典型的染色图片，应该是诱导不成功啊，不知道有没有高手诱导分化成功过啊，请指点指点？？; B' V9 ?* T  p+ h
   以下是我的诱导方法：将骨髓间充质干细胞以每平方厘米2＊104个细胞种植于6孔板中的生长培养基中。将细胞置于37℃、5%二氧化碳增湿培养箱中培养；细胞每3天换一次液直到100%融合后。 当细胞达到100%融合后每孔加入2毫升诱导培养基。3天后，将诱导培养基吸出，换成维持培养基。24小时后，将培养基换回诱导培养基。重复诱导培养基和维持培养基这样的循环3次。诱导培养和维持培养这样的循环后，再用维持培养基培养细胞7天，每3天换一次液。然后进行油红O染色。油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；5%甲醛室温固定20min；PBS冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录.
( Q/ j5 ~  ^" u1 h9 K& i    有没有哪位大侠做成功的，能发张图片看看吗？我的邮箱：tomars_2000@163.com,如果哪位要成骨诱导的图片我可以提供看看！
# ?# A& W( B2 ?- N. W7 B& c% }# D# N0 u! j% z

luoziwei

论坛里很多相关诱导的帖子的，配方，染色步骤等等都说得很清楚，你可以搜索并参考一下。

gact

, Q. s/ V9 z1 A  p# I/ G我诱导的结果
1 Q) [4 T8 q7 R; Z" c物种不同，不是小鼠的；" R% C3 b; H7 L- _0 Q+ R
21dayS结果；" b1 o) L4 j  A6 F
油红染色；8 P8 p- p: o6 C: ?" s# N
不过，拍照的时候是干燥的，照片不好看，应该加点pbs拍照，效果会好点；
- x8 o+ _. ?# R有明显的花环结构就可以了。1 {+ H; Z/ R4 H' w) e
10*40倍；

SKC-SFC

根据您的情况，我大概指出以下几个可能原因：8 q, V0 ^. q3 e# {  |
1.您的细胞接种密度偏低，100%融合应该是不够，应该密度大点更合适诱导分化。3 Q9 @4 g7 w# u( f& e% s
2.成脂诱导的时间，您好像总共在10天左右，一般来说需要21天，当然具体可以镜下观察是否有明显的脂滴.
! p5 R# y2 [/ O$ y  k3.也是很重要的一个方面，那就是您的成脂诱导培养基是否合格，您再配置的时候确保加入成分的准确。不要漏加关键成分.这个在很多情况下决定着诱导是否成功.6 Y) W" p9 U% u# D6 ~
4.油红0在使用前，一般采用异丙醇溶解，然后过滤，感觉透亮方可使用，过滤后要用去离子水稀释（一般为3:2）方可使用。

wangzhiqi86

不明白为什么用诱导培养基和生长培养基更换，我的做法是1×105cells/cm2的密度接种到孔板，一直使用的是诱导培养基，大概7天就有油滴出现了

havie

细胞生长融合度至少要达到80%才可以，诱导过程中，一直使用诱导培养基，10天就会有一部分细胞产生脂滴，若有更多的细胞产生脂滴，需要延长诱导时间。。

SKC-SFC

类似的情况我们也遇到过，我们做的羊膜上皮细胞诱导分化实验，成骨诱导图片非常的漂亮，但成脂诱导过程中，已经明显看到很多脂滴，但染色染不上的，而别的细胞类型却非常好。可能油红0染色有一定的局限性.

willow0711

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; a( v- e8 i& T& a4 V& Q7 K& o7 k9 H' Q) ~7 ]' v6 {
哦，请问，你后来是怎么解决染不上色的问题？是换别的染色剂了还是？？？谢谢！

倔强的投手

我用的猪的间充质干细胞，接种密度为1.5*105/cm2，80%左右confluence后，开始诱导7 b/ y6 ]. Y% k2 P
前两天的诱导液含有insulin,DEX, IBMX和rosiglitazone# M3 m$ e$ g; \! K, x
两天后换含有insulin和rosiglitazone的诱导液，每两天换液一次
# O1 w% U2 `) n) E( F五六天就能看到脂滴了，到2周左右基本就有很多脂滴了4 _! n, n, ^' a% ?3 x

SKC-SFC

回复 willow0711 的帖子
% D( Q1 R. F0 E9 o9 {# `5 S( D. b( \: T3 _+ g% }- R
是油红O本身的质量问题，更换之后可以的