RNA提取遇难题

sallyshaomy

各位大侠，在RNA提取过程中，异丙醇沉淀离心后，我获得大量RNA，但是在75%酒精洗涤后，再离心发现RNA诡异地消失了，本以为是离心的问题，但是我继续加大转速延长离心时间，依旧没有发现RNA，请问这是什么原因？期待大家的恢复，谢谢！

lingchen04

你确定异丙醇离心后没有把RNA倒掉？还有75%的酒精没有被污染？

xiongjiedeng

你用多少70%的酒精润洗沉淀呀，八成是操作失误吧，将沉淀随着酒精倒出去了，或者是你试剂被污染了，离心时得到的就不是RNA沉淀

snowama

应该是酒精浓度有问题了吧，不行换酒精，实在不行浓度稍微弄高点也问题不大

momocy

你的70%酒精是用什么配的？要用DEPC 水配，用dd水配RNA会被降解，你的应该是降解了。

mayansen1314

也许你不该相信你自己的眼睛，你用异丙醇沉淀的时候看到大量的大块东西也许根本就不是RNA，较纯的RNA应该是透明胶状，量不会太多，你用DEPC水配好的75%乙醇沉淀完了之后继续加DEPC水溶解，然后去测浓度及纯度，最后的浓度和纯度才能说明你提取的RNA质量如何

huangcong1988

回复 sallyshaomy 的帖子. Q/ e8 [# P; Q# Y. p2 C/ s6 ~( t6 g: H2 m
( |3 t* B; M& k: i- W
首先，用TRIZOL提RNA，几乎所有试剂都是需要用DEPC水配制的，另外，有些试剂需要预冷。4 D3 a' W9 s3 i4 e8 V
在异丙醇离心后有沉淀，不能说那就是RNA，因为在异丙醇沉淀后有一步：你要将该沉淀静置至沉淀呈半透明状，那个才可能是真正的RNA。0 u4 ^. T' ]/ F
所以并不一定很多，洗涤以后没看见沉淀可能是RNA不多，但是你弃上清后加一定量的DEPC水溶解测浓度或者跑胶，你可能有意想不到的结果
! r5 C  H* q" P( N; g还有，异丙醇沉淀后建议你最好不要用倒的，用枪头吸最好，吸出上清比较保险，不然容易将沉淀倒出也不一定0 ~' [1 ]0 L* A% m3 Q
最后一点，75%的酒精是体积比么？如果是质量比最好是70%，不然有可能是酒精的问题
. @" H% U8 I& n祝实验顺利！
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meridian

RNA提取时，所有试剂都需要RNA free处理（DEPC处理或者添加RNA酶抑制剂）。0 Z4 h) l0 I) Z) A
还有容易造成RNA酶污染的主要原因是手上的油脂，往往是RNA提取初学者产量低的主要原因。9 B, h" ?$ t( U+ e
根据你的描述，异丙醇沉淀后，75%酒精洗涤时，如果产量很大的时候，基本肉眼可见。很有可能是你倒掉了$ S* v) a$ ?* w+ b8 d
如果产量还是很少，可以考虑加长沉淀时间，当核酸浓度很低的时候，应该在低温（-20℃）用较长的时间（3-4h或者过夜）沉淀。当核酸浓度较高时，应该室温孵化沉淀效果较好。
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goodboy

我最近一次提取液也出现这种情况，因为样本是别人已经用Trizol处理过的，因此我拿回来之后从氯仿这一步开始做的，12000g4度离心15分钟后没有看到中间蛋白层，我估计是细胞太少或者只是Trizol.

yyshpy

应该是你自己的问题，要确定异丙醇沉淀后，没有把RNA倒掉，要确定75%乙醇是用DEPC水配制 的，这样肯定不会有问题的