有诱导过EMT的经验人士吗？能不能讨论一下，

markllq

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   一直在建EMT model，已经三四个月了，几乎没有什么进展，尝试过几种不同类型的epithelial细胞系。最开始用的是HT29细胞，通过过表达snail诱导，real-time和western检测的结果都显示snail表达量非常高，但是很奇怪，细胞一直看不出明显的形变，检测E-cadherin的mRNA水平和蛋白水平都没有差异。7 H  k; T% D" @$ o1 ^
   后来我们向weinberg实验室借了一株永生化的HMLE（immortalized human mammary1 C" J% k5 U0 e$ L& C, ?8 _8 d
epithelial cells）细胞系，这个属于正常细胞系，研究起来更容易。我们尝试用snail，twist以及tgfb三种方式诱导，从weinberg以前的paper来看，诱导一段时间后细胞会从紧密的上皮样变成松散，并且形状很长的细胞，但我们按照paper里面的方法诱导一段时间后（已经是第9天了），还是没有看到明显的形态变化。
  ~( W. C4 L) Y) [( p: u8 C    weinberg的paper里面关于EMT诱导的细节其实写的并不是很清楚，所以我担心是不是忽视了一些很重要的细节问题。比如血清的问题，这株细胞培养时是不能加血清的，诱导EMT的过程没有血清会不会有影响？另外，感染完细胞以后能不能继续用上皮细胞的培养基培养，还是需要换成其他的培养基？
& _1 K  f' u3 q$ h
5 |) _1 X6 w$ u' Z6 e! V! n( x# S+ ?恳请有EMT经验的同胞指点，不胜感激！+ R/ V6 e$ T5 ?: {$ v5 E

markllq

回复 胡问成 的帖子
: Y8 C7 `* Y7 I* W- W2 f1 k, E' a+ I
. V) R" x5 p7 ?. v, u$ i我们也试过tgfb，似乎细胞没有太大变化，似乎看不出明显的形态变化，你做过EMT吗？能不能交流一下？

markllq

回复 yac508 的帖子
8 Y9 h; P/ O9 ]1 P+ F1 V
9 \4 G5 W' x" r非常感谢！我们试过A549，用tgfb也诱导出来过，现在正在摸索HMLE细胞EMT的条件。希望能做出来。

markllq

回复 windy19840 的帖子* @2 \" b8 \" B/ a% Q) C, m' ^
0 @( k6 J; ]$ q5 ^8 |* n- H
你好，我的model现在已经建立好了也比较稳定，其他的细胞系也尝试过。HMLE的细胞我们这里冻了很多，但是毕竟是其他实验室赠送的，我们没有权利再次转赠。你如果真需要的话，建议跟weinberg发封邮件找他们借，weinberg人很nice，他们这株细胞已经借给了很多实验室，他应该不会拒绝。HMLE的细胞系缺陷还是很大的，首先是增殖非常缓慢，诱导一轮EMT下来需要半个月时间，其次是EMT效率不高，很多细胞都不能响应。因此可能有表型也难看出差异，用其他细胞系可能更容易做出表型。

markllq

回复 windy19840 的帖子6 c4 L' w+ L  e4 i: P* U. w$ F

& p  Y2 w5 f/ z他们是直接用干冰寄过来的，一两个星期就到了。这种细胞可以用tgfb直接诱导，或者过表达snail和twist都可以。

markllq

回复 hunter_33 的帖子5 X6 p" u' K: w% d8 a

& \! {. d2 n% o8 Z$ ~8 \& j用的培养基是严格按照weinberg lab的配方配的，不能见血清。细胞不会很纯，会有一些自发EMT，所以里面有一点点mesenchymal细胞也是正常的。你可以通过消化时间的长短或者用MSC把少量的masenchymal去掉。细胞状态跟细胞密度也是有关系的，细胞大概在70%的密度是长得最好，其他的密度不是很好看。

markllq

回复 hunter_33 的帖子
5 o( m, K1 v+ N: R7 C5 N4 L$ A8 P& ~
去掉血清，这个细胞不能见血清。用snail和twist诱导EMT时也不能加血清，但是用tgfb诱导时，可能要加少量血清，不然细胞会死。

markllq

回复 hunter_33 的帖子& f% t, [- t2 m) N4 |$ |  |! {

( T- w! c' S( Q4 B7 k8 t! ~我们用的是这个培养基，可以自己配啊。没血清可以长，只是会比较慢。所以用这个细胞诱导EMT的周期是比较长的，大概半个月

markllq

回复 hunter_33 的帖子
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" ]) \  _7 }! s5 n: I. V: ~% I给我你的邮箱，我把配方发给你。

markllq

回复 一路顺风 的帖子" o% V4 z" R1 m
) Y& H; l8 L/ h4 c: p& K
不知道你用的是什么细胞系。我试过人的HMLE和鼠的Nmumg两种细胞系。鼠的24h之内就能看到明显形变，很容易诱导。而人的细胞响应会慢一点，可能需要一个星期。用TGFB1诱导的时候是需要加血清的，不然细胞会死，密度要稀一点，20-30%的密度比较好，细胞种下去悬浮的时候就可以加。细胞大概长到70%的时候就传代，培养皿普通的就行。