关于慢病毒转染的几个问题咨询

wangwang1987

1. 刚刚在addgene买了几个plasimd. 但是又四个是以Tet-o 开头，有四个是以Ptight 开头.想知道有什么区别么.. r) G( ~  |$ C, {# P  M
2. 各位有用psPAX2和VSVg 包装的protocol么？因为刚刚开始没什么头绪的感觉，不知道具体用量.4 `3 \% `: z+ V: m6 O* R1 {

telomerase

我们用的是pMD2G的那个，过程差不多& C& \; S( o/ \2 _. M# c: ]2 [
和包装逆转录的过程一样，我们用的是lipo，方法请参照lipo用法* V) R$ w' @. C

1 w' w8 J' R& U* K要注意的是：
' q+ n' \8 ]. D# F质粒的比例比较重要, l8 t3 ?* W! o0 b! U
细胞的状态比较重要
8 N2 ?6 I/ @9 r. y8 c: |包完浓缩下，超离或浓缩柱
" h+ L4 q7 w; P- G/ j5 {感染时必需要加polybrene，离心效果更佳

wangwang1987

回复 telomerase 的帖子' f, {6 [9 N, a& {  L

$ Q; u) H- H; M8 V& {谢谢~还有一个问题就是2X HBS的PH的问题。因为不知道多少合适，我想验证那一个PH下可以滴度 更高。结果博后说太麻烦，让我直接做。现在只做了一个2X HBS加入细胞后第二天的液体的PH变化。我觉得这样很不准确的感觉~~但是也不知道怎么去反驳~~

telomerase

2X HBS- ?5 U7 A+ `3 n; i$ K  M2 a

. ?" n& M2 q3 k7 t. q280 mM NaCl-----8.18g / 500 mL" n( M, L6 W1 j6 {, _7 f

' U% L9 B* v& K8 N, @6 e* K* c7 V10 mM KCl-----.18g/ 500 mL
! z  B* c% F( I) S2 M5 s- f9 ]/ I& k
1.5 mM Na2HPO4 * 2H2O-----.2g of Na2HPO4 / 500 mL8 l* x* j: @4 G( C2 Q8 C6 s: `

+ J+ I, q# x0 s: M( B+ T12 mM Dextrose-----1.08g / 500 mL  ) A5 b! x, L* q7 a. w$ Q2 u
( F5 z, \# ^4 n% s6 V% z- @' c6 q+ W
50 mM HEPES----5.96g/ 500 mL 7 Z' _% ]1 K  h9 v- E

; ?2 E' B1 ~1 o- B4 dCarefully pH to 7.05 and raise to 500 mL volume. Aliquot and freeze.
. e5 B3 i. S0 f4 x. b是这个吗？没用过。。。。。。。。" k" e, q9 P9 r1 @
但看配方PH是一定啊！！！9 V6 U/ \. `2 F$ s/ g

daviddow

直接用lipo算了

daviddow

直接用lipo算了

huangcong1988

回复 telomerase 的帖子4 M# G  P# `5 M# U2 m# r2 o% T- ?

& t5 f/ R* \0 z2 S我直接是收集的慢病毒里面加PEG8000（终浓度为10%），然后混匀后静置过夜，然后6000~8000离心半个小时，然后就得到沉淀，这样行吗？我看他们有的加蔗糖，不知道我加PEG8000有影响么？

huangcong1988

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! r: N0 i/ ~+ p! w) N3 \/ i5 k: ~5 ]2 j* e1 |
现在包毒基本就是 FuGENE HD和lip2000，个人用的是lip2000，觉得效果还行，转染过程跟普通质粒转染差不多，要注意的也就是telomerase说的那些

wangwang1987

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3 z: a# F, k' Q2 y4 e. k- e) p+ t- n6 I- `2 o: \, D, `
谢谢~~

xxh83121

大家的慢病毒载体都是从哪里买的？是已经包装好基因的还是空载？新手，望大家支持