关于含EDTA的胰酶的使用问题

amney1

5 J7 }# j: J2 U& R& ?! N       请教各位前辈，文献里写如用含EDTA消化液，应先用HANKS液将消化液冲掉，再加培养基。那用含EDTA的胰酶消化全骨髓法培养的间充质干细胞时，具体应该怎样操作？7 M! j/ z+ ?! d
先加入HANKS液的话，消化下来的干细胞不是就随倒掉液体也一起被倒掉了吗？先加入HANKS液的话，消化下来的干细胞不是就随倒掉液体也一起被倒掉了吗？

jkfly

倒掉原来培养基，PBS洗，含有EDTA的胰酶消化，核固缩，细胞部分脱落，含血清培养基中和，离心，去上清，重悬。

qilan2012

溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，普通的HANKS液是含Ca2+、Mg2+的，所以用PBS或盐水冲洗培养基都比HANKS好吧。细胞间形成和维持紧密连接是需要Ca2+、Mg2+的，而EDTA的作用是螯合Ca2+、Mg2+，是用胰酶消化后脱离瓶壁的细胞进一步分散成单个细胞。用HANKS同样会对EDTA的作用造成影响。

receiver1

我们不用Hanks液，都用PBS。
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吸掉培养基，PBS洗。加胰酶-EDTA消化后，培养基（含血清）终止消化，用PBS收集细胞到离心管，1000r，5min，细胞可以计数冻存或传代。
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或者加胰酶-EDTA后，快速混匀一下（让所有细胞都接触到胰酶），然后弃掉胰酶，细胞只与少量胰酶接触。轻拍，等细胞消化下来后，直接加培养基，可以继续培养或按比例传代。

lxm5668

Demon_CN 说明的很清楚。HANKS也是一种缓冲液，与PBS的作用是类似的。

Demon_CN

首先，我们用胰酶的目的是让贴壁的间充质干细胞从壁上脱落下来，
% v8 A9 b  E) Q! l7 ~( N其次，加入EDTA的目的是螯合二价离子，提高酶的活性。
( y" T* ^, n" j# C3 @2 e6 {7 h6 O7 Y然后，注意事项，消化前要用盐水冲洗两边，目的去掉参与的培养基，提高消化效率；消化完了要加培养基终止消化（原因是培养基中蛋白质多你懂的）。' p0 r; G( p7 o. s6 \9 P2 ?) @4 p
最后，离心去上清（去掉胰酶什么的），得到细胞+ u) H! b) K+ ?$ J6 E7 c( u
所以不知道你加HANKS干嘛用的！