关于支原体检测

your1024

MEF没做支原体检测的话是不是不能用MMC处理来做feeder？请问大家都是如何进行检测的呢？我试过DAPI染色，可是看不出帖子里说的典型的支原体现象。我想问一下PCR和肉汤培养的具体内容是什么呢？不知道是不是我查的方式不对，一直没查出什么有价值的内容出来。能介绍一下或者推荐几篇文献么？谢谢！
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& u, @, l/ g% U" T( `; r. {7 g; l+ z补充内容 (2012-5-18 14:17):
: c8 }# _6 i3 Y0 j, ?4 o还有，想补充一下，如果碰到肯定是支原体的污染，只有果断扔掉么？有没有消除支原体的有效办法？

Yedan

PCR的方法，就是用支原体孢子的引物来P细胞培养基（培养细胞后24h收样），检测出来的条带约250bp。$ b% ~$ ^( n) Q* j2 X) |6 v2 C
肉汤什么的，没做过……
% G: L+ ]/ t6 |另外InvivoGen有个支原体检测的kit，是用HEKBlue细胞检测，我用过，比较好用，就是刚开始用比较贵，因为要买它那个细胞，底物不是很贵。$ R: C& `; ]; E2 W9 @
这两种方法都有一个关键就是一定要有阳性，和阴性对照，是一定要有。1 g+ w& _2 j! Q* d) [4 m3 N
理论上所有细胞都得做支原体检测，当然如果实验室觉得支原体不影响你们的结果，那也无所谓了。

ontheway_hit

      我们用的是R&D Systems公司的MycoProbe®试剂盒。该试剂盒运用“Elisa夹心法”的基本原理，首先将样品16S ribosomal RNA (rRNA)标上生物素标签和地高辛标签，然后将其加入预先包被在孔板上的链亲和素的微孔板进行捕获，同时加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛检测抗体检测，最 后加入底物显色，通过比色法得出检测结果。检测时需同时做阳性对照和阴性对照。这个方法灵敏度高，可以检测涵盖95％污染细胞培养的8种支原体。只是成本也比较高。   

ontheway_hit

我周围如果碰到支原体污染的话，是果断抛弃，目前好像没有什么有效的方法可以消除。为了试验严谨，我想这是应该的。

shihuijunm

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2 a# e3 }" d+ ^- I* d0 M2 E1 g& m1 G6 M" U( n4 d7 ]
是否能分享一下PCR方法检测的详细protocol或者相应的参考文献，具体的引物是什么，不甚感激！

ielisa

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6 S2 R- m& d3 f% W支原体引物，引物选自常见污染支原体种类16sRNA的保守区域序列,长度为472bp。引物A: 5′GGCGAATGGGTGAGTAACACG3′, 引物B: 5′CGGATAACGCTTGCGACCTATG3′8 Y$ F$ w0 U0 B5 l
PCR总反应体积为25μl,加入PCR缓冲液、氯化镁、Taq酶、dNTP、模板和引物,扩增条件为: 94℃预变性3min,然后94℃变性25 s,58℃退火45s,72℃延伸45s,循环30次后,72℃恒温7min。取9μl扩增产物与1μl 10×LoadingBuffer混合后,加入含0. 5μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶,75V电泳25min

shihuijunm

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谢谢你！非常感谢！