请教小鼠BMSC问题，困惑中

camus

本人用的全骨髓培养法来提取小鼠的BMSC，小鼠是BALB/C，6到8周龄，雄性。
; z: H% a! q8 d, l方法步骤如下：
- G3 G$ j+ b9 E; R! X0 H) L无菌条件下取出小鼠股骨跟胫骨
+ b- R& L4 }( |5 f用1ML的针管用LG-DMEM进行冲洗
( B6 Q% w/ W* T; |" `& l冲洗液过200目的筛子
: _$ `) y/ n) T8 A2 X: z然后将冲洗液离心
+ {3 s8 m, z2 mPBS冲洗两次，1000R/MIN，5分钟5 E- T0 P9 J/ \# P9 L  E& o
用10%FBS，1%双抗，89%LG-DMEM培养液重悬，计数( `. {0 ^9 S% m; E: W
调细胞浓度至1*10^6接种到小培养瓶中  Q8 A! e9 q) X; F) h- p
' k; `' A* T1 j2 R/ U! e/ v
整个过程大概在三个小时左右
/ [4 g/ {- A- D; C以上是提取方法，不知道哪里有不足，请指出
& {' F7 s. R7 Z3 U7 V( z; W) p
. `  r4 b, @$ o" n( z; ]4 {! r现在已经48小时了，细胞什么形态的都有，但是就是没有贴壁细胞，请问是否要进行半换液，另外请哪位大大把你们养的好的细胞的图片发来看看可以吗？小弟学习一下，万分感谢！

camus

另外，为什么我提取出来的细胞在离心后，红色较明显，是不是红细胞太多，是否需要在用PBS冲洗的时候，加一次红细胞裂解液破红？

luoziwei

48小时还不贴壁？估计MSC少吧，重新做一次

camus

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5 U- r6 H5 X6 w- J' a- V1 h$ E2 K
说错了，14个小时不贴壁，是不是小鼠的贴壁慢？上次师姐用了两只病鼠都12小时贴壁了，也是小鼠。。。。为什么 。。。

luoziwei

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8 \' v% k+ \, D: Y3 a- E
/ y' r: x4 [  r  G那再观察一下。也许能贴

muyuan

整个过程大概在三个小时左右:
1 B! y. {4 n1 e) A6 A# D时间是否有点长，影响细胞状态？

wuyannini

时间太长影响了细胞活性
1 {4 H& h# @1 w" L4 A另外，你调整的细胞是10^6，是不是所有的细胞加在一起的数量啊，如果是这样的话，应该是其中的干细胞数量不够。& g8 b! c' ^) I# P! o! d9 c
还有，14小时你不换液怎么会看到干细胞形态啊，即使看到了，应该看到的也是漂浮的细胞吧

xinxinxinliu

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" e- O# _7 K* Z! h3 N
# S( w) t7 x# _' ]1 o是要用红细胞裂解液将红细胞破坏掉" ], F- M% |% F$ B% y% I. z1 w/ _$ F

camus

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8 ]$ S' j) J& ~
5 N, }* l# g( Y% H  y' J. |5 g谢谢，已经贴壁了，有空上图，请鉴定一下

camus

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6 d- k& u) z; d9 X% C; }
3 E. C  K) g6 ~. ?( T7 n  W3 O那请问多少时间做完这个流程比较合适？谢谢解答~