请问hES细胞的转染

momocy

我想转染质粒到H9细胞中，咨询大家有什么好的方法么？转染后用药筛选建立稳定细胞系可行吗？求高手指导、给些经验。多谢！

wwy551

回复 momocy 的帖子. L* e/ X6 |1 I! ]6 f
0 w6 S, V% l" a1 R% i9 X, K
转染质粒的话用电转或者磷酸钙沉淀的方法吧，不过这样做都只是瞬时转染，转染进细胞的质粒独立于宿主细胞的基因组存在，会随着宿主细胞扩增丢失。所以如果想建系这样是不行的，建议用慢病毒体系来转基因吧，靶基因可以整合到宿主基因组中长期稳定表达，论坛里慢病毒包装体系的资料挺多，可以找找看。

momocy

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9 `! q& D1 z$ d* d  N+ S/ w我是转染干细胞，你做过干细胞的转染吗？用的什么方法？效率怎么样？

zack

2 V( F3 `- A5 [. ~5 y3 k

( j; `; j- k( T; V- Y7 s慢病毒转染干细胞，获得稳转细胞株还是可行的。因为干细胞转染的难度，相对来说，不是非常大。

wwy551

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4 L, a; z& z  _7 F4 F& B0 @7 a3 R# t: V, Q/ M
用慢病毒的体系做细胞建系，这个还做过挺多，我之前做hESC向HSC的体外定向分化，向H1里面转过HOXB4+EGFP，为了降低分化的造血细胞移植到小鼠骨髓后被排斥，还专门向H1里面转过mCD47。以转HOXB4为例，因为HOXB4基因后面带有EGFP reporter，我们用FACS分选的方法挑选出来表达靶基因的细胞建系，之后用了差不多一年半的时间重新FACS分选EGFP强阳性细胞，比例还能达到85%。我们做造血分化用到的共培养的基质细胞，有些也用了慢病毒体系转了促进造血发育的外源基因，经过检测也都OK~~

刘森泉

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: y, u* @# |6 q' x. s# X. [+ _8 o+ ?7 t3 E
请问下你们ES分化来的造血干细胞移植至NOD/SCID小鼠，还会有免疫排斥吗？还有，文献说hES即使转了HOXB4也不能体内重建造血，只有mES才行。你们用HOXB4在hES里过表达后能促进造血分化，能在小鼠体内重建造血吗？促进造血分化的其他外源基因你们做了什么？谢谢！

wwy551

回复 刘森泉 的帖子9 Z" F" ~  N3 M$ z" I
9 P. r- B# [* t5 ]& j. X. m& e
我们做hESC向HSC的分化，很大一个问题就是没有体内移植的data。即使是从人的cord blood里面分选CD34+细胞做阳性对照，移植的效率也不高。" n! c& R0 ?( H& X8 D; u% x/ j
确实像你说的，mESC过表达HOXB4可以移植重建，而hESC就不行。这也是mESC和hESC向造血分化不同的一个体现吧。个人觉得，对于HESC的造血分化，单过表达HOXB4并不足够，也许可以通过某种方式筛选出其他的协助因子，最终达到mESC单转HOXB4就能达到的移植重建效果。不过说到screen的话，工作量就上去了。。。。: P5 W1 O7 P! N1 f
促进造血分化的外源基因，我们实验室构建了将近30个。除了HOXB4，还有Cmyb，Runx1，Gata2，SCL，Zbp89，LHX1等。

刘森泉

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" z7 \: r1 [" T. y非常感谢你的真诚，谢谢！终于找到和我们做的工作几乎接近的实验室了，非常荣幸！1 l0 p! y! K- V9 a8 X& G+ W

! M  A) N9 Q6 @3 v4 [再请教，你们做了这么多基因的高表达，没有一个可以协同HOXB4达到体内重建的效果吗？
& B5 ]( ]$ d! z+ ~; c( B8 u
: @+ A, I1 L' j& H% N! S* B还有，如果方便的话私下里能给我留个你的具体信息吗？在哪个实验室，老板是谁。说不准可以共同合作。0 C  t1 P6 k/ L
# a3 z/ Q0 p3 }
谢谢！

shewawa

回复 momocy 的帖子# J1 ?, ^# Y) _1 L2 W$ d$ b& ?

! {! J) A) B; x' E8 m* \) z+ l$ p! d人的干细胞转染很难。因为是细胞团而且有feeder，普通的转染方法很难导入目的基因。而单离细胞团又会导致细胞的死亡分化。通过retrovirus转染基本不可能，只能用lentivirus，但是这样有存在titer非常低无法达到转染效果。1 P9 U9 Z9 B$ h. j3 j. v! G* S
所以要想达到理想效果要提高titer并且尽可能的转染所有ES细胞。7 M8 I" s' X- X/ p
提高titer用超速离心浓缩的方法。这方法经济实惠，比peg it浓缩方法更好。
7 E/ H8 m9 X/ J) a# ~转染更多的ES，可以回收ES去除feeder，用病毒转染后在放回feeder上。
0 q1 h: A) t% Q曾经听过更好的方法不过没记住，希望更有经验的人能给提供更好的方法。

wwy551

回复 刘森泉 的帖子5 X3 I( ~5 O7 `2 X& Z2 F8 h
" G$ v( F  y8 [7 v) X& U5 x( y! M
我们倒是有过表达不同外源基因的hESC，但是都是单个过表达的，没有在过表达HOXB4的基础上另外表达别的基因。我们当时重点做的是在体外把hESC向HSC的分化体系chemically define出来，主要用的就是普通的H1来做分化。至于向H1里面转了mCD47就是出于移植的考虑。0 M' Y6 d' H' E" \6 O) e
至于合作，你说晚了。我已经离开之前的实验室快一年了，现在已经做了完全不同的方向。不过有问题还是可以讨论，O(∩_∩)O哈哈~