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刘森泉 2013-12-23 11:38
你好,请教你一些问题。我现在在做ES向造血分化,用的是无基质无血清的方法,用的是邓宏魁老师发在cell research的protocol,但是我分化2天后细胞全部漂浮起来了,之后一直养着,有点像细胞碎片,不像细胞的样子。也检测不到CD34和CD45,不知道什么情况。你之前是怎么做的呢?谢谢!
刘森泉 2013-3-16 19:35
wwy551: 你先确定一下你想要克隆的基因在你选取的细胞里面是有表达的。拿到cDNA之后建议做巢式PCR扩增目的基因,就是分两步做:先用一对primer扩目的基因两端外侧的区域, ...
那怎么才能知道克隆的基因在哪个细胞里表达啊?有这样的网站吗?这些基因一般不是都在造血干细胞里表达吗,可是造血干很少很难拿到。还有,问下,你原来的老板邓宏魁实验室是不是都有这些基因啊?因为我老板跟他很熟,所以他有的话我可以叫老板问邓教授拿。谢谢!
刘森泉 2013-3-16 14:58
你好!请问下你以前克隆过造血相关的基因是伐,比如SCL,RUNX1,GATA1/2这些,请问你是从什么细胞的mRNA克的啊?我用K562,NB4这些白血病细胞株,试了好久都没克出来啊?
刘森泉 2013-3-13 22:11
wwy551: 这个其实我也没有做过,我以前呆的Lab也并没有标记的细胞系。找特定基因的启动子,一般情况下是针对这个基因起始密码子上游2000bp的区域设计primer,PCR扩增。当 ...
好的。我自己先试试。还是谢谢你!
刘森泉 2013-3-13 14:28
非常巧,在论坛里收细胞特异性表达基因构建又收到你的帖子,现在我也想做Lineage Tracing,就是将基因启动子跟GFP连起来,做稳定细胞株的建立。想请教下具体的流程是什么?包括启动子的查找、PCR扩增,载体的选择等等。谢谢!
刘森泉 2012-7-8 08:25
wwy551: 可以这样做,也可以直接把每孔的培养液吸掉,用下一阶段分化用的基础培养基把克隆洗一下,再换成分化培养基。这样做防止上一阶段残留的细胞因子对接下来的分化造 ...
谢谢!可是细胞都悬浮着,很难把培养基吸出来,怎么操作比较好点?还有,显微镜下看上去很多死细胞,属于正常情况吗?
刘森泉 2012-7-7 11:54
你好。请教下ES向造血分化的过程细节,我昨天把ES转到低粘附性六孔板里,用的还是ES培养基,今天看了下,全部飘在培养基里。那要往造血分化的话是把细胞再移出来,自然沉淀,再用分化培养基重悬培养吗?之后每步分化都同样操作吗?谢谢!
刘森泉 2012-6-7 08:39
wwy551: 我们当时对实验室的细胞因子库及某些因子对应的拮抗剂做了screen,筛选出来了SB431542对终生造血的祖细胞发生有促进作用。
分化按stepwise进行,每一阶段必须的因 ...
已经很感激你了,非常感谢!
请问你有邓实验室的研究生的联系方式吗?邮箱什么的。毕业的没毕业的都可以,我想找他们要个论文不知道行不行。
刘森泉 2012-6-6 15:42
wwy551 : http://www.nature.com/cr/journal/v22/n1/full/cr2011138a.html 这是我之前在北大的一篇paper。我已经离开之前实验室很久了,质粒之类的东西肯定是没有的,抱歉 ... 你的文章我看了,做得很好,打算按照你的分步分化法来做做看。请教几个问题: 1. 你怎么会想到采用TGFβ抑制剂来调节造血分化的呢? 2. 分化步骤很费钱啊,Matrigel包被的孔板好贵,还有,第一步分化你用的是BMP4和ACTIVIN A,在之前的WNT3A的blood方法比起来怎么样?你试过之前的分化方法吗,感觉哪个好点? 3. 这个SB431542有效果后有再进一步做其 ... ...
刘森泉 2012-6-6 08:38
wwy551: http://www.nature.com/cr/journal/v22/n1/full/cr2011138a.html
这是我之前在北大的一篇paper。我已经离开之前实验室很久了,质粒之类的东西肯定是没有的,抱歉 ...
已经很感激你了,非常感谢!
请问你有邓实验室的研究生的联系方式吗?邮箱什么的。毕业的没毕业的都可以,我想找他们要个论文不知道行不行。
刘森泉 2012-6-5 13:00
wwy551: 不好意思,邓博实验室的毕业生每个人都会留下打印装订好的毕业论文,但是我现在手头上还真没有电子版的毕业论文。
那你以前在邓实验室发的文章能给我参考下吗?还有,你们构建的质粒(RUNX1,SCL, HOXB4等等)你有吗?非常感谢!
刘森泉 2012-6-5 08:54
wwy551 : 你好!我之前在北大生科院邓宏魁的实验室工作了三年,今年才去港大医学院读PhD,所以毕业论文就没有啦~~你可以搜一下他们实验室做造血的paper,三篇blood和一篇c ... 原来是邓老师的学生啊,他好像今年要去同济了。我是浙江大学医学院的学生,老板是黄河,浙一医院的医生和浙大医学院书记,在基础方面(多能干)刚刚起步,你可能没听说过。我正好想按照邓老师之前发的文章做ES向造血分化呢,那以后有细节不懂的就请教你咯。他实验室发了一个BMP4,RA,Lycat三篇Blood,其中Lycat是按照他在国外做斑马鱼那篇文章做的小鼠模型, ... ...
刘森泉 2012-6-4 20:21
你好,怕公开联系不方便,就私下联系你了,见谅。我实验刚开始,很多细节不是很清楚,你正好做过这方面的,非常难得。有个奢求,你能把之前实验室做造血分化的毕业论文给我学习学习吗?谢谢!
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