有没有做过RNA-IP 的？

markllq

求助：有没有做过RNA-IP 的？我用一个抗体（cell signaling）和IGG（abcam）做的RIP，最后提完RNA（RNA 的总量差不多），做完反转，然后做QPCR，来检测我想要的mRNA的变化。用ACTIN 作内参，发现 actin  的ct值分别是 26（抗体）和23（iGG）, 检测的MRNA 的ct 值差不多都是29 ，这有没有问题？是否说明了我拉下来的mRNA是IGG的8倍？

xyz007

您好！这个内参差别那么大，而你要检测的mRNA却没有变化。不好说啊。想问一下你孵育完了是怎么处理的啊？先用RNA酶抑制剂什么的吗？: b- z8 Y9 v% A, i; e$ @) n. X) N* r4 `

markllq

回复 xyz007 的帖子- B( }1 f$ L& ^

4 R, b8 w1 h2 Z& _) \/ h我用的就是nature protocol 上的 方法。RIP-Chip: the isolation and identification of
0 U5 [* o! Y, {$ |; `6 `$ ^mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts 。
  K" M9 W. o# r1 R/ h& ^8 j孵育完后用NT-2 buffer + PK 酶 消化RNA ，然后用 Trizol reagent 提取RNA。 NT-2 buffer 中没有加入RNA 酶抑制剂。

xiphias

回复 markllq 的帖子3 E% ?8 s% |. G. \  {" i
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如果起始细胞量一致，只能说明实验失败啊。actin变化太大了。  

xyz007

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* _7 b6 G- N! j/ c: e/ c* C% j, k% j8 R' W4 r# Y9 t3 _2 E" X
那你做的实验组的抗体和RNA你确定他们有相互作用了吗？是已有文献报道了没有啊？如果没有，我觉得你有必要做对照呀