UBMC复苏产生絮状沉淀的处理

lixuejia

       冻存的UBMC复苏后，往往会产生白色絮状沉淀，这种沉淀在复苏后会产生，即使复苏后很少，在进行MACS磁珠分选加入磁珠孵育后，也会产生絮状沉淀，严重影响UBMC过柱，并进入影响分选HSC的百分率。
) t& n  R$ j" k  o) ^      絮状沉淀到底是什么呢？？我们认为主要是红细胞和粒细胞裂解后的产物（UBMC中含有的网织红细胞和粒细胞很难通过Ficoll法完全除去），可能包括DNA和蛋白，如何除去这些沉淀，而又不伤害UBMC中的HSC，是一个难题。# B$ z6 N% v* k6 l
      目前，我们课题组先后尝试了胰蛋白酶、DNase1、胶原酶（1和4）溶解沉淀，都没有明显的效果；同时尝试了冻存前裂解红细胞法，结果沉淀物产生的更多。
9 y% U$ F: y; [     因此，对于从事脐血干细胞分选的科研工作者，希望大家多尝试，有什么好的方法一起分享，争取攻克这一难题。加油！！！
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pengxuleo

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$ }- H6 E% C: Z1 f( E1 v, z
5 r) e  b# e. L' V! r我们冻存的浓度在1x10E7/ml左右，沉淀还是有的，
" z+ x8 ?& A. K& |: m  l8 d如果梯度离心的时候分离的MNC中红细胞少些的话就会好些的
; K% M! {" T# Z

lixuejia

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" P+ `" y' L& M" {0 l- }3 ]' l4 Q7 J* M! E
根据文献查阅，冻存UBMC的数量在2*108/mi以下都是可以的，但大部分文献中冻存UBMC都在500万~5000万/ml，我们目前冻存UBMC的数量一般在2000万~5000万/ml，感觉差异不大。不知道你们冻存的UBMC的浓度是多少?如果浓度太低，操作起来就比较繁琐（一个样品要懂好多管，占空间也大）。请指点，谢谢！

pengxuleo

回复 lixuejia 的帖子( g; Q1 W7 l" C1 t
4 T" r- P6 S4 {' @
这个问题我也遇到过，我们认为的原因和你们的相近，你们用的方法我们也都用过，当然也过滤过，并不是很理想。
! A3 K; Z; b. {  g- Q* I& P我们尝试过降低冻存是MNC的浓度，解冻时会好一些，你可以试试看

lixuejia

回复 ldhdunhe 的帖子, P- S4 W) r; T/ B

- f. D3 K' L3 {( b( Y絮凝除去红细胞，如何操作？我们尝试过红细胞裂解，红细胞裂解了，但是裂解后的产物很难从UBMC中除掉，结果复苏时，产生沉淀反而更多。

lixuejia

回复 lixuejia 的帖子$ o  j5 M) F3 n0 J: L0 F8 u

3 @% ]+ y" }* [, V% l1 f絮凝除去红细胞，如何操作？我们尝试过红细胞裂解，红细胞裂解了，但是裂解后的产物很难从UBMC中除掉，结果复苏时，产生沉淀反而更多。

ldhdunhe

不知道楼主的冻存前方案如何，前面加一步絮凝除去红细胞如何?另外血浆本身冻存复苏后会有絮凝物，冻存液不妨换换

lixuejia

絮状沉淀，过滤掉了，加磁珠孵育后，再次出现。纠结中。。。。。。

linzi214

那样的话建议分两批处理：先将未粘附的游离的UBMC分离出来，剩下成团的絮状沉淀可以尝试机械吹打或者胰酶消化的方法看看行不行。如果一起处理的话，细胞折腾的次数越多细胞活力越差

lixuejia

回复 linzi214 的帖子5 |* [. G; R& B6 B8 S; E

! ?% {/ U( h, H9 u7 }$ J( R谢谢你耐心的回复。现在关键问题是，这些絮状沉淀很黏，如果只是过滤除掉，同时会将沉淀网络到的UBMC过滤掉，造成UBMC的损失。所以，我们想如果避免沉淀，或者将沉淀融掉，释放UBMC.