求教关于人胚胎干细胞免疫荧光的问题

fish_zbw1985

8 r7 e+ d0 y0 N6 q. q  G- A1 o
: L! b4 |2 L( G& y3 O最近按照标准流程做人ES细胞核蛋白免疫荧光染色,发现经常出现克隆内所有细胞核全部着色的现象.不知道是不是做的方法有问题的缘故,个人觉得应该有很多是非特异结合的染色.请问有什么办法可以做出特异性较好的免疫荧光.附我的实验方案:
) b  X- n" ^' |( g% U& N1: 细胞用PBS洗一次后用4%多聚甲醛室温固定20min6 W$ \; @( l; f  Q1 ]7 y3 u0 o
2: PBS洗三次后用含0.2%Triton X100的PBS室温穿膜15min2 S2 g: B  I) j" U6 h
3: PBS洗三次后用10%二抗血清的PBST(含Triton X100)室温封闭30min3 p  \$ ?2 [4 g% I, D4 h8 P8 z
4: 用10%血清的PBS稀释一抗4度过夜
- u, A& @( b/ H8 m8 q& r8 Z& t! h% d5: PBS洗三次后用PBS稀释的二抗室温孵育1h+ K* b0 T0 j* A" q
6 : PBS洗三次后加PBS稀释的DAPI室温孵育3min5 N% }" s% y/ m2 |
7: PBS洗一次后在荧光显微镜下观察

zhlqlkpc

我觉得你的免疫荧光染色protocol没有问题。* {/ M! q( [) W/ ^: y  T! }* a
可以从以下几个方面考虑非特异性的问题) q: U+ a( q( b- }( `
1、一抗的质量问题。如果然其他的cell line 同样有非特异性的问题，可考虑此方面
6 y- Q" @9 E6 a8 @9 Q2、一抗浓度过高，不同的样本最适合的一抗的浓度并不完全一致，若染其他样本特异性较好的话，可以将一抗浓度减低一些试试。
: q/ k1 q& b$ [. f3、一抗染色后的洗涤效果不佳，非特异性结合较多。
. N! K" C% y% t2 C" U4、二抗浓度过高。
% X/ K2 s5 |2 Q  e6 u$ ?5、二抗与样本有交叉免疫反应，可考虑换一个厂家的二抗。
" m7 i/ i, i* k3 `, y以上几点是我们分析免疫荧光染色非特异性问题时考虑的几点，仅供参考。

fish_zbw1985

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( J( C9 I% H, x) W; ^% q+ }
/ }& u3 d/ X$ t( W1 v# z/ b感谢帮助！

李夏

我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4，SSEA即是否还有自我更新能力，但是效果一直不好，主要问题细胞经过多次冲洗到最后观察时已经掉下来了，由于我的药物是DMSO配置的不能紫外消毒，所以有时经过四天孵育后，细胞就染菌了。。。。有没有人能指点一下啊    感激不尽啊

李夏

我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4，SSEA即是否还有自我更新能力，但是效果一直不好，主要问题细胞经过多次冲洗到最后观察时已经掉下来了，由于我的药物是DMSO配置的不能紫外消毒，所以有时经过四天孵育后，细胞就染菌了。。。。有没有人能指点一下啊    感激不尽啊

细胞海洋

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/ }8 x3 R5 C$ k: {8 ~' V
  L: h! D, T0 S  n. a8 \$ @建议你发新帖提问

ruofan1982

! m! F1 i4 _/ @1 V. ]5 p* G+ m/ Q
The cell-surface-antigen expression of cultured cells can be analyzed by using immunofluorescence techniques. The following primary monoclonal antibodies are used to detect surface-antigen expression: anti-SSEA-1;anti-SSEA-3; anti-SSEA-4; anti-TRA-1-60; anti-TRA-1-81; and anti-Oct-4.
0 S8 T6 i0 g  t7 R6 d$ A: b6 {  @$ S3 }& m  |' y
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled secondary antibodies, appropriate to the species and isotype of the primary antibody, can be used for detection of primary antibody binding.
! I! j8 Y7 j6 q5 s2 A# v4 M& A9 }; D# i+ f0 N( |, f9 Q
1. Fix cultured ES cells in Fixative Solution for 15-20 minutes at room temperature.
7 h3 e. q5 D% V2 _6 j; f% t2. Wash twice (5-10 minutes each) with 1 X Rinse Buffer.
. F% B/ q+ x( }3. Permeabilize cells with 0.1% Triton X-100 / PBS for 10 minutes at room temperature. 5 C' q5 ^& E( F% n
4. Wash twice (5-10 minutes each) with 1 X Rinse Buffer.
% T  A2 ?# g, G! E0 P- ~# a/ f5. Apply Blocking Solution for 30 minutes at room temperature. & U( e) q  N+ N8 d$ A# X( i! E) j
6. Dilute primary antibodies to working concentrations in Blocking Solution (SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 & Oct-4 can be used in the range of 1:10 – 1:50). Incubate primary antibodies for 1 hour at room temperature. " l; o+ p1 g, z
7. Wash three times (5-10 minutes each) with 1 X Rinse Buffer. % G. @1 Y* `: G
8. Dilute secondary antibodies in 1 X PBS just before use. Incubate secondary antibodies for 30-60 minutes at room temperature.
+ T: r3 b+ ]# g1 \/ m6 Y9. Wash three times (5-10 minutes each) with 1 X Rinse Buffer. $ k* M; w0 U$ E( O) ]
10. If stained in plate wells, cells should be covered with 1 X PBS for visualization. However, if cells are stained on a coverslip, mount on a slide by using antifade mounting solution.
0 ]# n& Z. w1 n8 l1 V  f: C11. Fluorescence images can be visualized with a fluorescence microscope. ' ~% j2 u) f) u4 x8 O4 A# v( H1 U