求教关于人胚胎干细胞免疫荧光的问题

fish_zbw1985

0 V) l4 ^% D, h8 C1 L* p# G

# C4 ]& Q$ }; {' W最近按照标准流程做人ES细胞核蛋白免疫荧光染色,发现经常出现克隆内所有细胞核全部着色的现象.不知道是不是做的方法有问题的缘故,个人觉得应该有很多是非特异结合的染色.请问有什么办法可以做出特异性较好的免疫荧光.附我的实验方案:2 T5 ^$ R1 E* V1 w) m/ B5 O
1: 细胞用PBS洗一次后用4%多聚甲醛室温固定20min
( s/ T5 Y# D  s; a/ r6 E2: PBS洗三次后用含0.2%Triton X100的PBS室温穿膜15min
8 ~% o1 s, F) [' \3: PBS洗三次后用10%二抗血清的PBST(含Triton X100)室温封闭30min
( b$ k& g5 D4 u% I0 T. u, n8 B4: 用10%血清的PBS稀释一抗4度过夜
- W- |8 V2 s3 P6 E" U5: PBS洗三次后用PBS稀释的二抗室温孵育1h
, p9 f& g3 I: E0 V: Q0 K( b; O6 : PBS洗三次后加PBS稀释的DAPI室温孵育3min# w9 e8 V; v8 j! c" x, ]& W# U' i
7: PBS洗一次后在荧光显微镜下观察

zhlqlkpc

我觉得你的免疫荧光染色protocol没有问题。  ?' i! l5 a* C% ]+ m! \
可以从以下几个方面考虑非特异性的问题
2 w4 p7 f( P7 R( v5 a1 x2 K1、一抗的质量问题。如果然其他的cell line 同样有非特异性的问题，可考虑此方面
9 q! ^& F6 f- S1 t. h6 d1 ^2、一抗浓度过高，不同的样本最适合的一抗的浓度并不完全一致，若染其他样本特异性较好的话，可以将一抗浓度减低一些试试。: s! J- d1 u  I7 v/ `+ X
3、一抗染色后的洗涤效果不佳，非特异性结合较多。2 j$ _+ G. E' u5 P  i3 `( T4 r
4、二抗浓度过高。
" [! i, @, p; B% {% O5 ?; R5、二抗与样本有交叉免疫反应，可考虑换一个厂家的二抗。
" n# J  i& R8 `; G+ u以上几点是我们分析免疫荧光染色非特异性问题时考虑的几点，仅供参考。

fish_zbw1985

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+ i* c4 ~/ T! m; n- s, g8 ~6 ]. k
' N7 h- S2 g5 P感谢帮助！

李夏

我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4，SSEA即是否还有自我更新能力，但是效果一直不好，主要问题细胞经过多次冲洗到最后观察时已经掉下来了，由于我的药物是DMSO配置的不能紫外消毒，所以有时经过四天孵育后，细胞就染菌了。。。。有没有人能指点一下啊    感激不尽啊

李夏

我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4，SSEA即是否还有自我更新能力，但是效果一直不好，主要问题细胞经过多次冲洗到最后观察时已经掉下来了，由于我的药物是DMSO配置的不能紫外消毒，所以有时经过四天孵育后，细胞就染菌了。。。。有没有人能指点一下啊    感激不尽啊

细胞海洋

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4 s1 B; [% N* ]8 K# i/ I0 ?# F% ]9 L$ A" c% H* u8 n  d2 D
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ruofan1982

& X) c$ v5 Y' c
The cell-surface-antigen expression of cultured cells can be analyzed by using immunofluorescence techniques. The following primary monoclonal antibodies are used to detect surface-antigen expression: anti-SSEA-1;anti-SSEA-3; anti-SSEA-4; anti-TRA-1-60; anti-TRA-1-81; and anti-Oct-4.
0 s$ j+ i  b- M7 _0 V6 Z" D0 J7 B+ Y8 ]
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled secondary antibodies, appropriate to the species and isotype of the primary antibody, can be used for detection of primary antibody binding. 1 [" o1 ?2 `2 I: M' u

2 t. h3 [+ s% \. q% h# G" `0 p$ e1. Fix cultured ES cells in Fixative Solution for 15-20 minutes at room temperature.
( \' ~. J9 k* J6 B) y+ y1 D5 f# V2. Wash twice (5-10 minutes each) with 1 X Rinse Buffer.
0 u* ]: M# X' z3. Permeabilize cells with 0.1% Triton X-100 / PBS for 10 minutes at room temperature. 4 z. M$ R8 N8 G8 D; t2 P+ C
4. Wash twice (5-10 minutes each) with 1 X Rinse Buffer.
1 |& a, w" L% Y" L9 `3 S5. Apply Blocking Solution for 30 minutes at room temperature.
( {. G. V4 S6 u" C9 {$ i4 k8 U  [0 K6. Dilute primary antibodies to working concentrations in Blocking Solution (SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 & Oct-4 can be used in the range of 1:10 – 1:50). Incubate primary antibodies for 1 hour at room temperature. 4 W+ F6 k! n2 x! p2 ~' Y
7. Wash three times (5-10 minutes each) with 1 X Rinse Buffer.
) ]" ~0 U& I5 I. f8. Dilute secondary antibodies in 1 X PBS just before use. Incubate secondary antibodies for 30-60 minutes at room temperature.
9 D6 z5 d! L: M+ Y* J' K9. Wash three times (5-10 minutes each) with 1 X Rinse Buffer.
% ^& `3 T0 ]1 c$ t+ L8 `$ ~10. If stained in plate wells, cells should be covered with 1 X PBS for visualization. However, if cells are stained on a coverslip, mount on a slide by using antifade mounting solution.
, ?" X' o! L' N7 q( ?' I; M4 z11. Fluorescence images can be visualized with a fluorescence microscope. . ]7 r$ |; ^9 {  ^, V