现在开始准备养小鼠成纤维细胞，请前辈们赐教。

暗红色的风

我准备要开始诱导IPS细胞，现在第一步养小鼠成纤维细胞。我定一周大小BALB/C mice，组织块培养法：从师兄那里得到的Protocal  请大家分析补充。谢谢。在冷的PBS中将尾部皮肤剪成1mm3的小块，真皮朝下贴在干的100mm培养皿，放入培养箱15min等组织块上的PBS干后（防止漂浮），每个组织块滴100ul 左右的FBS培养过夜。第二天加入10%FBS的培养基，大约4-6天成纤维细胞长出组织块。消化传代，用3-5代的细胞感染。同时请问大家成纤维细胞的培养基：普通的DMEM，10%FBS. 双抗。请教成熟的培养方法。谢谢。

刘森泉

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0 a7 l8 C- T$ ~7 S' q
关键在于防止污染，细菌真心难对付，我已经做了好几次了，都以污染告终。

暗红色的风

回复 刘森泉 的帖子4 A& m) _+ h8 f- M! P) E: k: }" O

" U& c* D' I- Y+ M0 ?9 x请问有成功的经验吗？" b+ \2 [3 G# ^$ H& Z, e
您的Protocal 是怎么样的，可以借鉴一下吗。谢谢

刘森泉

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8 \6 {' r- y3 i% E% x* c0 P
6 o: G. v/ F9 f$ ~* E& hhttp://www.stemcell8.cn/thread-57892-1-1.html

yuhaoze

我还是喜欢用胎鼠做，污染率小一些

牙牙丫丫123

你可以试试这个~我们做还好~污染也是有的~不过只要洗的够干净就没问题~# y7 G: I4 k( F: E
一、成纤维细胞原代培养
. d8 ]9 Y8 C% s, }% x1．取材) a! t+ l3 L1 }) U
取取剃毛后的组织（1cm2），置于盛放PBS（加双倍双抗）15ml或者50ml的离心管中，放置于冰上准备带回实验室取材用。
$ S9 u4 w( a( I, M- d2 b* \2．材料处理       
$ d; {0 a" ]( X  s) P& |（1）组织带回实验室后用加有双倍双抗的PBS冲洗后的置于3.5cm培养皿中，用手术刀去除皮毛和骨。
8 E! D$ I: p' q; w2 D: v$ ~# K（2）在盛有DPBS的平皿中，用镊子将耳缘组织上残余的毛拔掉，反复清洗，直至DPBS中无任何杂质为止。7 z9 ]. w9 }$ _- H9 r% Z0 W* U
（3）将组织放入一小皿中，尽量将其剪碎，呈糊状，加入少量培养液。. P5 N# i4 T" v, I% e
3．细胞培养4 z7 O$ L$ Q, X6 A  o- k
（1）收集组织块转移至15ml离心管中，离心1000rpm，3min。" z4 s. H7 u& ?8 T8 G
（2）弃去上清，以培养基重悬组织块，转移至T25培养瓶中，尽量将组织块均匀分布，同时小心吸去组织块周围的培养基。6 b4 \" ], X9 V2 \7 O5 z
（3）倒置培养瓶37℃过夜培养，次日翻转，加入1.5ml培养基。
7 _/ Z" e! K, E7 Q（4）隔日换液，约4日可见组织块周围有细胞爬出。

暗红色的风

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( R6 J; w5 L3 Y7 {. V
2 L0 I' D) s. F, k非常感谢，准备明天试试，谢谢！

暗红色的风

回复 牙牙丫丫123 的帖子. p. X8 Q" R* M" b+ h' j
# t9 s/ R+ N. i" e" e3 ]) i
请问PBS加多大双抗浓度？谢谢！

暗红色的风

回复 yuhaoze 的帖子
" S' N% [0 s( `7 Y4 h3 f. ]/ m) L. I
2 {3 s: Q6 v# [0 h1 X& ?谢谢，因为刚刚开始养细胞，胎鼠太贵了，所以先用成年的鼠培养成纤维细胞，等有了经验后面再养胎鼠细胞做Feeder。请问您做IPS细胞先是取的胎鼠成纤维细胞，后面养feeder也是胎鼠的吗？

暗红色的风

回复 yuhaoze 的帖子0 {* `$ S8 r8 P- G) L) h

3 N1 R8 Z; y& @- n! I9 I. H- _谢谢，因为刚刚开始养细胞，胎鼠太贵了，所以先用成年的鼠培养成纤维细胞，等有了经验后面再养胎鼠细胞做Feeder。请问您做IPS细胞先是取的胎鼠成纤维细胞，后面养feeder也是胎鼠的吗？