荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

caomin307

FISH探针的长度一般为300bp-1kb，标记方法主要有缺口平移法(nick translation)和随机引物法(random primer)两类技术。
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* i# c# j) W/ K+ W使用缺口平移法制备，在极微量DNA聚合酶的作用下，在双链DNA分子的一条链上切开若干个缺口，然后，大肠杆菌DNA聚合酶I在切口的3’-OH端逐个加入新的带标记的核苷酸，同时由于该酶具有5’-3’外切酶的活性，它同时切除5’端游离的核苷酸，3’端核苷酸的加入和5’端核苷酸的切除同时进行导致切口沿着DNA链移动，最终形成高比活性的均匀标记的DNA探针，用于荧光原位杂交相关实验。根据这个原理，如果用高强度的放射性核苷酸（通常为α-32PdATP）置换先前存在的核苷酸，则可制备比活性高达108cpm（每分钟计数）/μg的32P标记DNA。用缺口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求。2 H7 s( v% k4 W! Q' ?