荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

" m$ m) m( F, A, m, D" u) o+ x) [& `8 ?/ F- t
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？
4 N- ^2 \% G9 a0 N% I3 x5 ^* q
3 l( |& b9 K$ Y! F看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。0 r4 B- q# I+ c) q
不知道是否有探针数据库可以查询？
/ Q# j: L6 Z, y4 _: r5 h0 Q4 v  n/ R, A( F
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？+ Q) Y3 L6 o, R
$ ]6 H. \3 R; w0 d6 [8 t. @
求高人指导~/ g  O2 C; Q7 C  @, K7 \7 H

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子) {! B5 e4 ^3 c' T0 K" h
6 i2 p# \6 @2 w! E- ~: g( V
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

0 I- B8 a; b( }7 }% ~/ N% O7 D* i0 o" t( j% w0 [! f
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
7 G& h. E+ v3 D5 D# P用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
* J7 {7 N. {! k2 k# D- j1 [上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
# `7 m% k, |5 E" |8 L  c, Y9 ^ standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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3 O$ ]+ [1 _# w
( L0 x* T/ O% V果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 3 ?- v/ J* [2 w* [& m" |# M0 H
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

$ g+ m. J+ p& S3 u附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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. D; L) b7 `- B- `8 E5 o. m/ M. f; h, I, Q+ h
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。
8 ^1 ?* u. [( _) U! HTA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。2 z$ [( _0 M0 [/ @
几点注意：4 R8 i9 b0 _6 g3 o
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
9 x6 w' Y% e" K2 v: W2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。
/ I6 {) D! e! @3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
3 L4 }3 v9 S5 R4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。% C% u( M8 s# _1 \, ~* L( _. H& j" p) ?

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子* o( Q9 l/ V5 b# \; {$ s& c, }/ X$ y
4 l& w3 W$ h6 X6 a! V/ r
第一次已经失败了啊，唉，呵呵