分子克隆：现在问题估计出在了连接上，因为空载体单切自连做转化不成功

yaolinzhang

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大家好！我做载体已经有三个多月了，还没做出来，很着急！现在问题估计出在了连接上，因为空载体单切自连做转化不成功，但单独空载体做转化能长满平板。连接酶换了三个公司的；温度一般用“16度过夜”，后面又试过“16度4h，4度过夜”及"22度3h",均不成功；胶回收试剂盒也换了两次；另外，载体浓度一般在40ng/ul-90ng/ul之间；片段浓度在30ng/ul-40ng/ul之间；比例按说明书上的载体及靶片段摩尔之比为3:1。我不知道问题出在了哪里？求各位高人指点，多谢！！！

weiyepan

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* N  |- F# I0 c+ I9 J5 M  E
PCR产物是5'羟基末端，酶切过的地方是5'磷酸末端。" O" U- R& r3 ?5 A& }( Y
如果磷酸酶处理过的片段，那5'也是羟基末端。
  M4 S6 {  X% I: t2 e; s4 a" w7 J连接只能在5'磷酸和3'羟基之间进行。

yaolinzhang

回复 刘森泉 的帖子: z  p3 ^- O. k$ q

4 m* A/ x3 P' q: e+ B. f我们的片段是加在T载体上扩增的，然后做的酶切

yaolinzhang

回复 weiyepan 的帖子8 h% r" D5 m1 x# ~$ y9 s
/ R% H6 p, x$ Z4 x+ H/ _3 ?! E* P
非常感谢您的宝贵建议，我明天试试，谢谢！

yaolinzhang

和你差不多，好的

刘森泉

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9 D5 Q6 J% A& }  G. n, l* Q7 g  ]" G2 Y( W
你造血是做什么方面的呢？我做多能干向造血分化，以后多交流哈。

刘森泉

回复 weiyepan 的帖子" B$ {6 s& n! S0 r
4 L+ B! v. p( }8 e$ @
一般载体切完都是跑胶回收的，而且用水溶的。
$ n" g4 S6 D% r; [PCR产物是用高保真酶做的，应该会有磷酸末端吧，具体有没有怎么鉴定啊？

weiyepan

回复 yaolinzhang 的帖子+ R; @% S* F% f+ G7 k* \1 |6 o
- {) ~8 W( a' f4 F
切完载体之后有cleanup过么？5 K9 U; p9 g9 x. ?
T4 ligase对盐浓度比较敏感，如果你使用的高盐的酶切buffer就要先做个cleanup，不要直接在里面连。$ p/ n) @- s6 N# @
另外可能是有质粒有外切酶污染，建议酶切之前80度煮个10分钟再加酶。/ c) r/ b% E+ ^7 s# Z: Q  Q
最后一个最简单的可能，你片段保证是有磷酸末端的吧？

yaolinzhang

回复 刘森泉 的帖子) E, ^' `- K; |! n( o0 z8 i

& ?2 w1 t& p; p, A' A/ m: k. ~6 K不好意思，权限限制，不能给你留言

yaolinzhang

回复 刘森泉 的帖子. H( A' u3 J! r$ Q/ W- r' O! u: P

1 v: D- F) D% M  J" D! P我在做造血干，好像你也在做。是吗